TERC基因、HPVL1蛋白在宫颈癌筛查中的应用研究

宋明慧

目前，宫颈癌是唯一一种能够预防、降低病死率和早期治愈[1]的癌症，我国每年有约14万新发病例，占全球新发病例总数的三分之一[2]。高危人乳头瘤病毒(human papilloma virus,HPV)是致病主要病因，越来越多的学者关注HPV相关的基因、蛋白的异常表达，染色体端粒酶RNA基因(human telomerase gene,TERC)扩增能够阻止细胞凋亡，导致宫颈病变[3]。人乳头瘤病毒蛋白L1(human papilloma virus protein L1,HPVL1)是HPV结构蛋白，当HPV感染后HPVL1表达缺失，宿主无法对其进行识别，不能产生抗体，也不能及时清除，导致肿瘤发生[4-5]。虽然TCT、HPV检测互补了低敏感度、低特异度的缺点，但是为了了解感染HPV后的发展趋势，进行风险评估，本研究探讨TERC、HPVL1在筛查宫颈癌中的应用价值。

对象与方法

1.研究对象：2015年9月—2017年9月在我院妇科门诊体检有性生活的女性1 280例，排除妊娠期、月经期、激素治疗史、宫颈手术史，均进行宫颈癌TCT筛查、HPV检测。研究对象年龄(21～62)岁，平均(39.3±4.5)岁，TCT筛查、HPV、TERC、HPVL1检测中任一项阳性结果者均进行阴道镜下活检及病理学诊断，以病理结果为金标准。

2.方法

(1)标本采集：研究对象禁止性生活、禁浴及阴道冲洗24 h，毛刷在宫颈口顺时针方向转动3～5周，分别用于TCT、HPV、TERC基因、HPVL1蛋白检测。

(2)TCT检测：新柏氏2000全自动制片机(美国赛迪公司生产，型号ThinPrep 2000)处理，固定、染色，显微镜下阅片。

(3)HPV检测：采用TM导流杂交检测HPV-DNA，按照核酸分子快速杂交试剂盒说明(香港凯普生物公司)，检测高危HPV(16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、CP8304)和低危HPV(6、11、42、43、44)。高危位点出现蓝色为HPV阳性。

(4)TERC基因检测：采用荧光原位杂交FISH技术(北京金菩嘉科技公司)，显微镜下每例观察100个杂交信号强的细胞，正常细胞核为红绿色信号各2个，而TERC基因异常扩增时红色、绿色信号分别大于2个。计算阈值=(异常细胞平均数+3×标准差)×100%。本研究对50例健康者宫颈细胞进行FISH检测，计算实验阈值为6%。因此检测阈值结果>6%，为TERC基因阳性；若=6%，需要增加细胞数量进行检测；若<6%为阴性。

(5)HPVL1蛋白检测：采用免疫组化法(美国爱迪旺斯医疗公司)人乳头瘤病毒检测试剂盒，细胞核出现红色为HPVL1阳性。

(6)阴道镜活检：暴露宫颈，进行醋酸白试验、碘试验，在阳性部位活检，深度达到宫颈上皮基底层，置于甲醛液中固定，行病理检查。

3.统计学分析：采用SPSS 17.0分析，各组间敏感度、特异度比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1.TCT结果：1280例中，TCT异常者占25.2%(323/1 280)，包括非典型鳞状上皮细胞14.2%(182/1 280)，低度鳞状上皮病变8.2%(105/1 280)，高度鳞状上皮病变2.8%(36/1 280)。HPV检测结果显示：1280例中HPV阳性者22.3%(286/1 280)，包括低危感染者1.0%(13/1 280)，高危感染者20.9%(267/1 280)，混合感染者0.5%(6/1 280)。TERC阳性者7.0%(90/1 280)，HPVL1阳性者4.7%(60/1 280)。

2.阴道镜活检结果：TCT、HPV检查结果任一异常者进行阴道镜下活检462例(36.1%)，病理结果：宫颈炎症20%(256/1 280)，宫颈病变16.1%(206/1 280)。病变包括：CINⅠ5.3%(68/1 280)，CINⅡ5.9%(76/1 280)，CINⅢ3.9%(51/1 280)，鳞状细胞癌(SCC)0.8%(11/1 280)。

3.诊断性试验结果：联合筛查中TCT+HPV+TERC或HPVL1的约登指数最高，真实性最好。各种筛查方法指标见表1。

表1 不同筛查方法的筛查指标分析

4.宫颈癌TCT、HPV的表达:随着宫颈恶变严重程度增加，TCT、HPV阳性表达率上升，Normal、CINⅠ期、CINⅡ期、CINⅢ期、SCC各组间TCT、HPV阳性表达率比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2 宫颈癌TCT、HPV的表达

5.宫颈癌TERC、HPVL1的表达：随着宫颈恶变的严重程度增加，TERC基因检测阳性率上升，HPVL1蛋白阳性表达下降，Normal、CINⅠ期、CINⅡ期、CINⅢ期、SCC各组间TERC、HPVL1阳性表达率分别比较 (P<0.05),见表3。

表3 宫颈癌TERC、HPVL1的表达

注：与HPVL1阳性率比较，*P<0.05

讨论

宫颈癌筛查中TCT、HPV初筛敏感度较高，假阳性率高，因此HPV阳性患者需要分流检测，提高宫颈癌筛查率。仅9%的患者HPV感染持续2年以上，临床医生进行风险评估及准确的治疗，可以减少宫颈癌的发生[6-7]。HPVL1蛋白阳性表达具有诱发免疫细胞产生抗体清除感染细胞，但是当HPV病毒整合到宿主细胞基因中，造成HPVL1壳蛋白表达缺损，宿主细胞不能产生抗体、无法识别并清除病变细胞，因此HPVL1蛋白可预测感染细胞的趋势[8]。有研究[9-10]指出，在宫颈癌组织及转移组织中TERC阳性表达随肿瘤期级别升高而增加。因此TERC基因是评价预后的指标。①TERC基因检测鉴别诊断宫颈癌病变的高度、低度准确率达90%[14]，可以预测转归。②对宫颈病变治疗后的效果评估。③对宫颈癌术后患者，早期预测复发及转移情况。

本研究结果显示，随着CIN病变加重，TERC基因检测阳性率增加，本研究结果与马玉兰等[11]结果一致。本研究中TERC基因阳性85例(76例宫颈病变)，特异度较高，因此将TERC作为预测宫颈癌指标。本研究结果表明，随着CIN病变加重，HPVL1蛋白阳性表达下降，说明免疫抗体减少，细胞免疫反应减少，高危HPV持续感染，则发生CIN、宫颈癌的几率增加，因此将HPVL1蛋白作为预测感染的趋势。本研究结果发现①单独检测TCT敏感度较高，但是特异度较低，考虑慢性炎症刺激导致假阳性。②单独检测HPV特异性较低，考虑多数女性有一过性感染导致假阳性。③TERC、HPVL1单独检测时，敏感度低，但特异度较高，说明TERC、HPVL1单独使用有局限性；若TERC、HPVL1分别联合TCT或HPV检测时灵敏度提高，但约登指数无明显变化。④TCT联合HPV检测时，敏感度、特异度比单独使用时均提高，约登指数较高。⑤TCT联合HPV，联合TERC或HPVL1检测时，敏感度明显提高，约登指数最高，说明此时真实性较好、准确性较好，但由于TERC、HPVL1检测成本较高，因此在经济条件允许情况下，建议TCT或HPV任一阳性患者均进行TERC、HPVL1检测评估病变风险，能够指导临床分流管理及治疗。

综上所述，HPV阳性检测分流时，HPVL1能较好地预测宫颈癌变的情况；TERC能够诊断宫颈癌的病变程度及预后情况。TCT+HPV联合TERC或HPVL1检测时，特异性及约登指数最高，可准确地预测宫颈癌发生发展情况。