微波辅助蛋白质水解-反相高效液相色谱法测定饲料中的色氨酸

赵 艳 ， 宋 军 ，3*， 张艳红 ， 杨发树 ， 张凤枰 ， 刘耀敏

（1.四川威尔检测技术股份有限公司，四川成都 610041；2.通威股份有限公司，四川成都 610093；3.西北农林科技大学，陕西杨凌 712100）

色氨酸通常以游离或结合态广泛存在于生物体中，是人类和动物必需的8种氨基酸之一，其作为一种功能性的氨基酸，在提高动物的摄食量、生长性能，促进营养物质的消化吸收等方面发挥着重要的作用 (王荣发等，2011；陈娥英等，2006；苏有健等，2005）。因动物体本身不能合成色氨酸，所以饲料中色氨酸的平衡和补充就显得十分重要，而准确检测饲料及其原料中色氨酸的含量，对于保证饲料的质量具有重要意义。目前，测定色氨酸的方法有多种，包括分光光度法 (徐礼生等，2014）、毛细管电泳法 (杨晓云等，2001）、电化学法 (杨晓云等，2001）、氨基酸分析仪法（Li等，2015）、反相高效液相色谱法 (杨永丽等，2016； 李成成等，2016；Cevikkalp 等，2016；Yust等，2004）和高效液相色谱串联质谱法 （王佳佳等，2016；徐开成等，2016）等，其中以反相高效液相色谱法最为常用。色氨酸通常以蛋白质的形式存在于样品中，首先需要进行水解，解离为游离态后才能测定。目前通常用常规碱水解法（GB/T 18246-2000，2001）。然而常规碱水解方法耗时，步骤繁琐，且水解过程不易控制。而采用微波辅助蛋白质水解样品，快速、简便，特别是易于控制碱水解条件，重现性好。国内外采用微波辅助蛋白质水解-反相高效液相色谱法测定饲料中色氨酸的报道甚少，本文充分利用微波蛋白质水解仪的优势，既节约了试剂，又节省了样品前处理时间，旨在为饲料中色氨酸的质量控制提供一种检测方法选择。

1 材料与方法

1.1 仪器、试剂和材料 Thermo U3000超高效液相色谱仪，DAD检测器，Chromeleon色谱管理系统，美国Thermo Scientific公司；CP225D电子分析天平，德国Sartorius公司；ETHOS 1微波水解仪，意大利Milestone公司；Allegra 64 R离心机，BECKMAN COULTER公司；KQ 5200B型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司。

L-色氨酸（L-Trp，纯度 99.5%）标准品，美国sigma-Aldrich公司；乙腈、甲醇（色谱纯），美国Fisher公司；磷酸二氢钾、乙酸钠（分析纯），国药集团化学试剂公司；其他试剂均为优级纯；水为Milli-Q Gradient超纯水。

饲料原料及成品：四川当地饲料市场采集。

1.2 标准溶液的配制 准确称取适量色氨酸标准品100.0 mg（纯度 99.5%），用适量水和数滴0.1 mol/L的氢氧化钠溶解，并用水定容至100 mL，配成质量浓度为1 mg/mL标准储备溶液，可根据需要稀释成系列标准溶液。

1.3 HPLC分析条件 色谱柱：Syncronis C18色谱柱，250 mm×4.6 mm，5 μm； 流速：1 mL/min；柱温：30℃；检测器：DAD检测器，检测波长：220 nm；流动相：等度洗脱，0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液+乙腈＝90+10（V+V）。

1.4 供试样品溶液的制备

1.4.1 常规碱水解法 参照国标GB/T 18246-2000碱水解方法进行样品前处理。所有样品重复3次测定，结果取平均值。

1.4.2 微波辅助蛋白质碱水解法 将样品粉碎，准确称取样品20 mg（精确至0.01 mg）于聚四氟乙烯管中，加入5 mol/L氢氧化钠溶液0.5～1 mL，依次放置于水解槽中，水解主控罐内加入5 mol/L氢氧化钠溶液120～150 mL，盖好水解罐。将水解罐放入密封装置中，拧紧，插入温度传感器，抽真空，充入高纯氮气以保护样品，重复3次。在1000 W功率条件，常温-160℃升温20 min，160℃温度保持30 min，当温度冷却至室温后打开密封装置，取出水解槽，将微波水解瓶逐一取下后，将水解液全部转移至25 mL容量瓶中，用6 mol/L的盐酸溶液调至中性，超纯水定容至25 mL。摇匀后，10000 r/min 离心 10 min，过 0.22 μm 滤膜，待高效液相色谱上机检测。

2 结果与讨论

2.1 样品前处理条件的选择

2.1.1 微波辅助蛋白质水解条件的优化 考察不同微波水解温度（140、150、160、170 ℃），以及不同微波水解温度保持时间（20、30、40 min）对实验结果的影响，最终选择160℃温度保持30 min为最佳条件。

2.1.2 微波碱水解法与常规碱水解法的比较 为证明方法的可靠性，在采用微波碱水解测定样品中色氨酸含量同时，运用国标GB/T 18246-2000的常规碱水解法110℃水解20 h进行测定，并将测得的结果用T检验法进行了比较，结果见表1。结果表明，两种水解方法测定结果的相对偏差均小于3.0%，经T检验，微波碱水解法与国标方法常规碱水解法测定结果不存在显著差异（P＞0.05），在所选择的条件下微波辅助蛋白质碱水解测定结果与国标方法常规碱水解法一致。

表1 两种水解方法色氨酸含量的比较（n=3）%

2.2 高效液相色谱分析条件的选择

2.2.1 波长的选择 利用DAD二极管阵列检测器获得色氨酸光谱数据，得出其在190～800 nm范围内的最大吸收波长。色氨酸在220 nm和280 nm波长下有较强吸收，220 nm比280 nm的响应高6倍，因此，选用220 nm作为检测波长，从而降低色氨酸的检出限。

2.2.2 流动相的选择 为了使色氨酸与其他组分达到完全分离，分别以甲醇/水、甲醇/乙酸钠溶液、甲醇/磷酸、甲醇/磷酸二氢钾溶液、乙腈/磷酸二氢钾溶液作为流动相，考察这些体系对色氨酸分离情况的影响。结果表明，选择甲醇/乙酸钠溶液体系时部分饲料中的杂质会对色氨酸的分离造成干扰，在改用乙腈/磷酸二氢钾溶液作为流动相后，分离情况大为改观，而且用乙腈作流动相可以大大降低流动相的背景干扰。另外，研究了乙腈体积分别为5%，10%和15%时，色氨酸的出峰效果。结合色氨酸的保留时间，色谱峰的对称因子，干扰情况等一系列实验，最终选择乙腈/磷酸二氢钾溶液（10∶90，V/V）作为流动相。本实验在所选择的条件下，标准品和饲料样品的分离效果见图1和图2。

图1 色氨酸标准品的色谱图

图2 饲料中色氨酸的色谱图

2.3 线性关系及检出限的考察 分别准确吸取适量色氨酸标准储备溶液，用水配制成浓度分别为 0.2、2.0、4.0、20.0、40.0 μg/mL 的色氨酸系列标准工作液。按照上述色谱条件进样，以色氨酸质量浓度为横坐标（x），对应的峰高为纵坐标（y），绘制标准曲线。回归方程：y=3.3965x＋0.0937，相关系数为1.0000，表明浓度为0.2～40 μg/mL时线性关系良好。以3倍信噪比计算检出限，以10倍信噪比计算定量限，本方法检出限为0.025 mg/g，定量限为0.075 mg/g。

2.4 方法的精密度和回收率实验 为研究方法的精密度和可靠性，在不同种类的饲料样品中分别添加3个浓度水平的标准溶液，每水平6个平行样，按照1.4.2样品溶液制备方法进行处理，按照1.3仪器条件进行测定，回收率结果见表2。结果显示，色氨酸的回收率为93.0%～95.5%，相对标准偏差为1.26%～2.72%，符合实验要求。

表2 色氨酸的回收率和测定的相对标准偏差（n=6）

2.5 样品中色氨酸的测定 按上述方法，分别测定饲料原料及成品中的色氨酸含量，结果见表3。

表3 样品中色氨酸含量测定结果（n=4）

3 结论

利用微波辅助蛋白质水解-反相高效液相色谱法测定饲料中的色氨酸，方法简便快速、重现性好、分离效果良好、灵敏度高、检测结果可信度高，可以满足饲料及其原料中色氨酸的检测需要，同时为饲料配方调整提供理论依据，对于指导饲料企业生产、加强饲料产品控制具有十分重要的意义。