青贮饲料中纤维素降解细菌的分离与鉴定

孟建宇， 徐慧欣， 纳荷芽

（内蒙古农业大学生命科学学院应用与环境微生物实验室，内蒙古呼和浩特010011）

青贮饲料是将含水率为65%～75%的青绿饲料经切碎后，在密闭缺氧的条件下，通过厌氧乳酸菌的发酵作用，抑制各种杂菌的繁殖，得到的一种粗饲料（玉柱和孙启忠，2011；张玉婷和胡柏林，2008）。青贮饲料可为家畜提供具有良好营养和口感的冬季青绿饲料，还可以解决大量秸秆废弃物带来的环境问题。为进一步改善青贮饲料的口感和营养，越来越多的研究将重点放在生物性青贮添加剂上（丁琳等，2017；侯美玲，2017），尤其是微生物制剂和纤维素酶制剂的添加已成为牧草营养学中的研究热点 （黄勤楼等，2017；原现军等，2013）。

纤维素酶可将秸秆纤维类组分进行降解，降低纤维含量，增加乳酸菌发酵所需的底物，生成乳酸，降低pH，抑制有害菌的生长，减少营养物质的损失，并利用菌群代谢的各类活性物质调节动物的免疫等，以改善青贮饲料的品质（丁琳等，2017；宋鸽等，2017；赵士萍等，2016；Guo，2014）。纤维素酶产生菌通过产生纤维素酶，降解饲料中难以利用的纤维素为单糖或双糖等可溶性糖，为乳酸菌、酵母菌的发酵提供更多的糖分，从而有助于其在青贮中发挥自身有益作用，促进青贮发酵（郭威等，2017）。

目前用于青贮饲料研究与应用的纤维素酶主要来源于真菌，但所应用的菌株仍存在纤维素降解能力低、活性不够稳定、产酶成本较高和pH作用范围小等问题。因此，获得高效降解纤维素的菌株对提高青贮饲料营养品质及利用率具有重要的意义（黄勤楼等，2017）。本试验以青贮饲料为研究对象，通过富集培养（李详和黄勇，2010；张晶，2007）富集样品中的纤维素降解菌，在CMC-Na培养基上分离纯化，由16S rDNA序列分析法对筛选到的纤维素降解菌进行鉴定，为今后的纤维素降解菌在青贮饲料中的高效利用提供更多的基础信息和理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验样品 青贮饲料由内蒙古天宝生物科技有限公司提供。

1.2 培养基 CMC-Na培养基：羟甲基纤维素钠5.0 g/L，MgSO40.5 g/L，KH2PO42.0 g/L， 酵母抽提物 2.0 g/L，琼脂 20 g/L， 蒸馏水 1000 mL，pH 8.8，121℃灭菌 30 min。

1.3 菌种的富集筛选和分离纯化 将青贮饲料样品用无菌水振荡浸提过夜，吸取上清液注入到富集培养基中，放于恒温培养箱中28℃倒置培养3周。从富集培养瓶中吸取菌液，然后进行稀释，将稀释好的四个梯度（10-2、10-3、10-4、10-5）的菌悬液分别吸取1 mL，加到CMC-Na（自然pH）培养基平板上，用涂布器涂布均匀，在恒温培养箱28℃培养2～3 d后，挑取单菌落再于培养基上划线纯化，重复以上步骤直到得到纯的单菌落。

1.4 菌种的16S rDNA序列分析 纯菌DNA的提取参考胡晓红等（2008）的方法。选用细菌通用引物对27F（5'-TACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATA-3'） 和 1492R （5'-AGTAAGGAGGTGATCCAACCGCA-3'）进行PCR扩增。PCR产物采用SYBR GreenⅠ作为标记，在1%（W/V）琼脂糖凝胶，1×TAE缓冲液中进行电泳测定。以Marker DL2000作为对照，在紫外灯下观察DNA谱带，照相。将PCR产物交由北京华大公司测序。获得的核酸序列用GenBank数据库中的序列进行Blast相似性比较。

1.5 酶活的测定 采用DNS法 （段杰，2015）对纤维素降解菌的酶活进行测定。将分离得到的单菌落接种于液体培养基，在常温条件下摇菌三天。吸取振荡浑浊的菌夜2 mL，在3000 r/min，常温下离心3 min后，吸取1 mL的上清液即粗酶液于试管中，加1mL 1.0%的CMC缓冲液后于50℃恒温水浴中反应30 min，取出后加入2.5 mL DNS试剂，于沸水浴中煮沸5 min，冷却后用1 cm比色皿在540 nm下测定其OD值，查阅葡萄糖标准曲线，计算含糖量。按照IUPAC推荐的国际标准方法测定，以IU/mL表示。一个酶活性单位（IU）定义为1 min内转化底物产生1.0 μmol还原糖 （以葡萄糖计）所需的的酶量。

2 结果与分析

2.1 纤维素降解菌的分离筛选 经过反复划线分离 纯 化 ， 得 到 Gs7、Gs10、Gs3、Gs9、Gs11-2 和Gs12六株降解纤维素的细菌。其中，菌株Gs3、Gs7、Gs9和Gs12的菌落形态特征基本相同，为圆形凸起，乳白色，边缘光滑且光泽不透明；Gs10的菌落形态特征为圆形凸起淡黄色，边缘光滑且有光泽不透明；Gs11-2的菌落形态特征为均匀圆形凸起，乳白色（表 1）。

表 1 菌株 Gs3、Gs7、Gs9、Gs10、Gs11-2、Gs12的菌落形态特征

2.2 菌株的鉴定 以细菌16S rDNA通用引物27F 和 1492R 对菌株 Gs3、Gs7、Gs9、Gs10、Gs11-2和Gs12的DNA进行PCR扩增，PCR产物电泳结果如图1所示。扩增片段长度约为1500 bp，符合预期片段长度，为目的片段。用NCBI数据库的Blast程序对获得的16S rDNA序列进行比对分析，发现6株纤维素降解细菌分别来源于2个不同的属， 即 Gs3、Gs7、Gs9、Gs10 和 Gs12 均属于乳杆菌属 （Lactobacillus），Gs11-2属于醋菌属（Acetobacter），其同源性都为 100%（表 2）。

图1 菌株的16S r DNA片段的扩增结果

表2 菌株16S rDNA序列的Blast同源性分析

2.3 菌株的酶活测定 采用DNS法对分离到的6株纤维素降解细菌的纤维素酶活进行了测定。菌株Gs3的相对酶活为36.20 IU，菌株Gs7的相对酶活为24.24 IU，菌株Gs9的相对酶活为61.70 IU，菌株Gs10的相对酶活为35.57 IU，菌株Gs11-2的相对酶活为25.50 IU，菌株Gs12的相对酶活为35.89 IU。

3 结论

纤维素酶广泛应用于医药、食品、棉纺、环保及可再生资源利用等领域，其是一种安全、高效的生物催化剂，可水解纤维素、半纤维素成为可被动物或乳酸菌利用的糖，有利于发酵，降低青贮料中的粗纤维，同时释放出细胞内的各种营养物质，提高有机物利用率，从而改善饲料的营养价值和消化利用率（黄勤楼等，2017；廖奇等，2017；赵士萍等，2016）。自然界中能够产生降解纤维素酶及降解作物纤维素的微生物很多，因此，纤维素降解菌的筛选是纤维素酶制剂生产及应用过程中最基础的工作。本文从内蒙古的青贮饲料中分离得到了6株纤维素降解细菌，经16S rDNA序列分析，Gs3、Gs7、Gs9、Gs10 和 Gs12 均 属 于 乳 杆 菌 属（Lactobacillus），Gs11-2 属 于 醋 菌 属 （Acetobacter）。其中，Gs9的纤维素酶活较高，为61.70 IU，是一株可应用于饲料微贮的微生物制剂参考菌株，值得进一步研究。