输合配穴针刺法促进脂多糖LP S早产鼠脑损伤中MAG及NgR表达的研究*

李 楠，胡晓丽，王雪峰

辽宁中医药大学附属医院，辽宁 沈阳 110032

人类新生儿尤其是早产儿存在高风险的脑损伤。脑性瘫痪定义了一组非进行性机能损害综合征，明显存在于胎儿期或出生后早期生活阶段。每千名新生儿中就有2.5名脑性瘫痪儿童［1］。然而脑性瘫痪早前被认为主要是由于产时窒息缺氧引起的，实际上这个原因只占了引起儿童脑性瘫痪原因的一小部分。最近的研究证明了胎儿或羊膜腔感染与脑性瘫痪有相关性，可以引起神经发育障碍如神经分裂症［1］和帕金森氏病［2］。然而，引起脑性瘫痪大部分的病因仍然未知。近年来，流行病学研究显示产妇感染包括泌尿系感染，牙周感染都有可能与子宫内的炎症、早产、低出生体质量、子痫前期和脑性瘫痪有关［3-4］。尽管细菌脂多糖(LPS)、活性氧、促炎细胞因子参与了发病机理，但产妇或胎儿感染危及胎儿发育的机制尚不清楚。LPS可以直接诱导炎症反应(如IL-6)和抗炎细胞因子(如IL-10)。LPS进一步诱发介质本身的氧化应激诱导细胞因子的产生［5］。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 由辽宁中医药大学动物实验中心提供孕17天SD大鼠13只，平均体质量320克，动物实验合格证号：SCXK(京)2007-0001。

1.1.2 脂多糖(LPS)溶液的配制 将1 mg LPS由Sigma公司提供(Lipopol-ysaccharides，Escherichia coli 055：B5溶于10mL生理盐水中。

1.2 方法

1.2.1 造模方法 将10只脂多糖组孕鼠从孕17天开始到出生，每12小时注射200 μg/kg脂多糖，3只生理盐水组孕鼠给予腹腔注射同剂量的生理盐水［6］。设定孕22天前分娩的仔鼠为早产鼠。本实验将LPS足月产乳鼠剔除，新生早产鼠随机分配为针刺组和非干预组。观察者采用盲法的方式随机分配每只孕鼠接受脂多糖或生理盐水注射以减少偏差。

1.2.2 动物分组 本实验中5只孕鼠腹腔注射脂多糖后于孕22天前分娩仔鼠56只，其中6只死亡，剩余50只仔鼠随机分为针刺组(n=30)和非干预组(n=20)。此外，3只孕鼠腹腔注射生理盐水后，于孕22天分娩仔鼠30只，无死亡，从中随机选出20只做为对照组。到生后21天为止，针刺组和非干预组均死亡5只，对照组无死亡。

1.2.3 干预方法 选取出生后3日龄针刺组仔鼠给予针刺治疗，按照“输合配穴”理论选取“曲池”“三间”“足三里”“陷谷”进行手针治疗，日一次不留针，干预至仔鼠3周龄。非干预组及对照组正常喂养不予干预措施，全部乳鼠每日进行一次神经行为学检测。

1.3 观察指标

1.3.1 新生鼠发育测试结果 按照Wu等［7］人提出的新生鼠13项生长发育测试，分别为平面翻正、觅食反射、悬崖回避、负趋地性、前肢放置、前肢抓握、耳朵抽搐、惊愕反射、空中翻正、活动力、睁眼时间、悬吊试验、旷野试验。全部新生乳鼠从出生后第1天至第21天，每天从第1项至第11项进行一次测试，出生后第21天对第12项和第13项进行测试以避免出现选择偏倚。观察者采用盲法，两人为一组对乳鼠进行评估。反应时间设定为30秒内，无反应计分为30秒。

1.3.2 病理观察 乳鼠出生后，取胎盘做HE染色，以观察孕鼠宫内感染情况，以大量中性粒细胞浸润做为判断标准。

1.3.3 MAG及NgR表达的测定 针刺组和非干预组2组分别于仔鼠出生后7天，14天及21天各随机选5只断头取脑用于制作石蜡切片，应用western blot方法观察MAG及NgR的表达。

1.4 统计学方法 使用SPSS 16.0统计软件包，计量资料采用(±s)表示，采用方差分析方法(ANOVA)进行比较。P＜0.05表示有差异有统计学意义。

2 结果

2.1 新生鼠发育测验结果 平面翻正、悬崖回避及惊愕反射针刺组、非干预组与对照组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。前肢放置测试针刺组与对照组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)，非干预组与与对照组比较，差异有统计学意义(P＜0.01)。悬崖回避测试针刺组与非干预组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。悬吊实验、旷野实验3组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。负趋地性测试和耳朵抽搐测试这2项未测出结果。见表1。

表1 新生乳鼠神经生长发育测试结果 分

2.2 蛋白免疫印迹结果

2.2.1 MAG的表达 脂多糖新生乳鼠生后7天即可见MAG的表达，生后14天逐渐升高，生后21天逐渐下降但仍高于生理盐水组。针刺组和对照组生后7天相对光密度值分别为(0.251±0.006)和(0.149±0.006)，差异有统计学意义(P＜0.01)；生后 14 天分别为(0.267±0.017)和(0.155±0.014)，差异有统计学意义(P＜0.01)；生后21天分别为（0.310±0.007)和(0.166±0.005)，差异有统计学意义(P＜0.01)。见图1—2。

图1 乳鼠脑组织MAG免疫印迹分析，1-3分别为对照组生 7d、14d、21d；4-6 分别为针刺组生后 7d、14d、21d

图2 MAG不同时间点相对光密度值， 各组比较有显著性差异（P＜0.01）

2.2.2 NgR的表达 随发育成熟NgR的表达逐渐增强。生后7天即可见NgR的表达，生后14天至生后21天NgR的表达逐渐增强。针刺组及对照组生后7天相对光密度值分别为 (0.234±0.006)和(0.114±0.004)，差异有统计学意义(P＜0.01)；生后 14 天分别为(0.289±0.006)和(0.131±0.003)，差异有统计学意义(P＜0.01)；生后21天分别为(0.335±0.007)和(0.186±0.004)，差异有统计学意义(P＜0.01)。见图3—4。

图3 乳鼠脑组织NgR免疫印迹分析，1-3分别为对照组 生后 7d、14d、21d；4-6 分别为针刺组生后 7d、14d、21d

图4 NgR不同时间点相对光密度值， 各组比较有显著性差异（P＜0.01）

3 讨论

脑白质损伤的特征是丧失前髓鞘少突胶质细胞，是早产儿脑损伤最常见的形式，并伴有神经发育障碍的高风险［8］。其中最严重的损害发生在不成熟的大脑，可以导致类似于脑性瘫痪的终身运动、姿势及认知的失调［9-10］。WMI的病理生理学是很复杂的，产妇感染是其发育过程中的重要因素［11-12］。

《灵枢·邪气藏府病形》曰：“荥输治外经，合治内府。”就是说输穴多治疗经脉的外周病证，肢节竣痛及五脏病变。五输穴之井、荥、输、经、合与人体皮、脉、肉、筋、骨、脏腑的对应关系也具有相似对应的主治规律。合穴位于肘膝关节附近，是经气由此深入进而会合于脏腑的部位，历来医家多认为其具有较强的健脾强胃，扶正培元，提高脏腑功能的作用，则多治脏腑的内在疾患。通过上述分析，本实验中选用的输合配穴法，至阴经即为原合配穴法，阴经之五输穴中合穴为井穴之母，根据针灸中“补母泻子法”，进针时两穴均采用补法，可直接调节五脏之原气，激发患儿原动力；至阳经进针时采用泻输补合之手法，以舒筋通脉，调节筋肉不利之症。从而起到和内调外，标本兼治的作用。

髓磷脂相关糖蛋白(MAG)表达于CNS的少突胶质细胞和PNS的雪旺细胞，是髓鞘的重要组成成分。随着后来研究的深入发现MAG具有双重作用，即一方面可以抑制发育中的小脑、成熟胚胎背根神经节(DRG)及NG108-15细胞轴突的生长，另一方面能够促进新生DRG轴突的生长，主要取决于神经元的年龄。国外有研究报道NgR基因可以影响小鼠的行为。

此实验首次采用国外对于脑瘫乳鼠机能和认知发育评估使用的神经生长发育测试项目，对新生乳鼠从出生后第1天至第21天每天进行系统检测。通过对孕鼠腹腔注射脂多糖后可以引起乳鼠脑白质损伤，但是并不能出现与中度至重度脑瘫患儿一致的脑性瘫痪表型。此外，通过神经行为学鉴定后发现，使用“输合配穴”针刺法治疗还是有效的。

本动物实验设计的目的是，研究通过慢性刺激的炎症反应引起未成熟少突胶质细胞损伤增加。但是由于研究的时间过短，并没有观察到LPS处理组老鼠表现出脑性瘫痪的表型特点。今后进一步的研究将重新设定LPS使用时间和剂量，以及神经行为学观测时间，以观察LPS处理组老鼠从幼年期到成年期的变化。