HPLC法同时测定舒肝平胃丸中柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的含量

苏 丹

(重庆市涪陵食品药品检验所，重庆 408000)

舒肝平胃丸收载于《中国药典》(2015年版一部)[1]，由厚朴、陈皮、麸炒枳壳、法半夏等7味中药组方而成。能疏肝和胃、化湿导滞，用于治疗肝胃不和、湿浊中阻所致的胸胁胀满、胃脘痞塞疼痛、嘈杂嗳气、呕吐酸水。目前，其质量标准[1]设立了厚朴中的有效成分厚朴酚、和厚朴酚的含量测定，文献[2]也报道了采用高效液相色谱法(HPLC)测定其中苍术的有效成分苍术素，但对处方中其他药味成分含量无测定报道。为了更好地控制舒肝平胃丸的内在质量，保证其临床用药的安全有效，在前期报道的基础上[3]，本试验建立HPLC法同时测定其中橙皮苷、柚皮苷和新橙皮苷的含量，为制定其质量控制标准提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器 安捷伦1200型高效液相色谱仪(包括在线脱气机、四元泵、自动进样器、VWD检测器、安捷伦色谱工作站，美国安捷伦公司)；梅特勒-托利多XP204型和XPE205型电子分析天平(瑞士梅特勒公司)。

1.2 试药 柚皮苷对照品(批号110722-201111，纯度为93.2%)、橙皮苷对照品(批号110721-201316，纯度为95.3%)、新橙皮苷对照品(批号111857-201102，纯度为99.6%)，均购自中国食品药品检定研究院。水为超纯水，乙腈为色谱纯(购自迪马科技公司)，其他试剂均为分析纯(购自成都市科龙化工试剂厂)。舒肝平胃丸(购自山东方健制药有限公司，批号为20160610、20160822、20161208)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：Agilent XDB-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液(18∶82)；流量：1.0 ml/min；检测波长：283 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 μl。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液的制备 分别取柚皮苷对照品、橙皮苷对照品、新橙皮苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成含柚皮苷217.5 μg/ml、橙皮苷361.9 μg/ml和新橙皮苷215.3 μg/ml的对照品贮备液，于4 ℃贮存，备用。分别精密吸取柚皮苷对照品贮备液1、2、4、6、8和10 ml，橙皮苷对照品贮备液1、2、4、6、8和10 ml，新橙皮苷对照品贮备液0.5、1、2、3、4和5 ml，各浓度点分别置同一25 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得混合对照品溶液。各个浓度的混合对照品溶液中，柚皮苷对照品的浓度为8.70、17.40、34.80、52.21、69.61和87.01 μg/ml；橙皮苷对照品的浓度为14.48、28.96、57.91、86.87、115.82和144.78 μg/ml；新橙皮苷对照品的浓度为4.31、8.61、17.23、25.84、34.45和43.07 μg/ml。

2.2.2 供试品溶液的制备 取舒肝平胃丸(批号为20160610)适量研细，精密称取1 g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇100 ml，称定重量，加热回流1 h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，续滤液用0.45 μm微孔滤膜滤过，作为供试品溶液。

2.2.3 阴性样品溶液的制备 按照舒肝平胃丸的处方比例及制备工艺制备缺陈皮、枳壳的阴性样品，并照“2.2.2”项下方法制成阴性样品溶液。

2.3 专属性试验 吸取混合对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液各10 μl，照“2.1”项下色谱条件测定。结果柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和其他成分均达到基线分离，理论塔板数均不低于5 000；阴性样品溶液色谱图中在与供试品溶液色谱中柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷相应保留时间位置上未见色谱峰，说明其他药材对测定无干扰。色谱图见图1。

2.4 线性关系考查 精密吸取各个浓度的混合对照品溶液10 μl注入液相色谱仪，以浓度为横坐标(X),峰面积为纵坐标(Y)进行线性回归，各成分在各自线性范围内均呈良好的线性关系。结果见表1。

表1 线性回归方程

2.5 精密度试验 精密吸取最高浓度的混合对照品溶液10 μl，连续进样6次，测得柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷峰面积的RSD值分别为1.2%、1.2%和1.1%(n=6)，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验 取同一供试品(批号20160610)，于0、2、4、8、12和24 h，按照“2.1”项下色谱条件进样，测定各成分的峰面积。测得柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷峰面积RSD值分别为1.4%、1.5%和1.8%(n=6)，表明在室温条件下，供试品溶液在24 h内稳定性良好。

1.柚皮苷 2.橙皮苷 3.新橙皮苷

2.7 重复性试验取 取同一供试品(批号20160610)，按“2.2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，照“2.1”项下色谱条件，测得柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的平均含量分别为：5.61、8.62和3.03 mg/g, RSD值分别为1.2%、1.2%和1.3%(n=6)，表明该方法的重复性良好。

2.8 加样回收试验 取已知含量的供试品(批号20160610)9份，每3份1组，每份0.5 g，精密称定，分别加入对照品贮备液(低浓度组：8 ml；中浓度组：10 ml；高浓度组：12 ml)，再加入甲醇，使加入的溶剂总量为100 ml，再按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，照“2.1”项下色谱条件测定，计算回收率，结果柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的平均回收率分别为99.0%、99.7%和99.2%，RSD分别为0.9%、1.0%和0.8%，结果见表2-4。

表2 柚皮苷加样回收率试验结果(n=9)

表3 橙皮苷加样回收率试验结果(n=9)

表4 新橙皮苷加样回收率试验结果(n=9)

2.9 样品测定 取供试品3批，每批3份，按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下测定，记录峰面积，外标法测定样品中各成分含有量，结果见表5。

表5 样品含量测定(n=3) mg/g

3 讨论

3.1 提取方法选择 本试验选取甲醇为提取溶剂，并考查超声提取和回流提取对三种有效成分提取率的影响，发现后者提取率较高。再考查回流提取0.5、1和2 h的提取率，发现1 h后提取率无明显提高，故选择回流提取1 h。

3.2 最大吸收波长选择 取橙皮苷、柚皮苷、新橙皮苷对照品的甲醇溶液，进行紫外吸收光谱扫描，在283 nm波长处均有最大吸收，且无杂质干扰，故以283 nm作为检测波长。光谱图见图2。

图2 橙皮苷(A)

3.3 流动相选择 参照2015年版《中国药典》中枳壳、陈皮含量测定的洗脱条件[1]以及文献[4-6]中对三种成分含量测定的报道，本试验考查了乙腈-0.1%磷酸作为流动相。舒肝平胃丸药味多，成分复杂，最终确定乙腈和磷酸溶液的比例为18∶82，各成分可以达到较好的分离效果。陈皮、枳壳是舒肝平胃丸中具行气宽中功效的药对，本文确定了橙皮苷、柚皮苷和新橙皮苷作为目标成分，建立了同时对舒肝平胃丸中该3种成分进行定量测定的HPLC法，结果显示，该方法简单、准确、重复性好，能够为舒肝平胃丸的质量控制提供精确的检测手段。