云南甘蔗病毒性病害的分子鉴定

冯小艳 沈林波 赵婷婷 熊国如 王俊刚 杨本鹏 王文治 冯翠莲 张树珍

摘要：【目的】了解5種常见甘蔗病毒性病害在云南的发生情况，明确其病原病毒的种类和分布，为制定云南地区甘蔗病毒性病害的防治策略提供理论依据。【方法】利用PCR和RT-PCR对采集自云南保山、临沧和德宏3个甘蔗种植区的113份样品进行甘蔗花叶病毒（Sugarcane mosaic virus， SCMV）、高粱花叶病毒（Sorghum mosaic virus， SrMV）、甘蔗线条花叶病毒（Sugarcane streak mosaic virus， SCSMV）、甘蔗黄叶病毒（Sugarcane yellow leaf virus， SCYLV）和甘蔗杆状病毒（Sugarcane bacilliform virus， SCBV）的分子鉴定。【结果】113份甘蔗样品中有89份检出病毒，病毒检出率为78.8%，检出的病毒种类有SrMV、SCSMV、SCYLV和SCBV，检出率分别为5.3%、11.5%、20.4%和70.8%，未检出SCMV。30份样品存在病毒复合侵染现象，复合侵染率为26.5%，其中有27份样品为2种病毒复合侵染，占23.9%，3份样品发生3种病毒复合侵染，占2.7%;未发现4种或5种病毒复合侵染的现象。【结论】目前云南地区甘蔗病毒性病害由SrMV、SCSMV、SCYLV和SCBV引起，其中SCBV广泛分布，SrMV、SCSMV和SCYLV具有一定程度的分布;病毒复合侵染现象明显，以2种病毒复合侵染为主。

关键词： 甘蔗;病毒性病害;分子鉴定;云南

中图分类号： S435.661                        文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）11-2198-06

Molecular identification of virus diseases

in sugarcane in Yunnan

FENG Xiao-yan， SHEN Lin-bo， ZHAO Ting-ting， XIONG Guo-ru， WANG Jun-gang，YANG Ben-peng， WANG Wen-zhi， FENG Cui-lian， ZHANG Shu-zhen*

（Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences，

Haikou  571101， China）

Abstract：【Objective】The occurrence of five common sugarcane virus diseases and the species and distribution of their pathogenic viruses in Yunnan were studied to provide theoretical basis for the development of control strategies for sugarcane virus diseases in Yunnan. 【Method】A total of 113 sugarcane samples collected from three sugarcane growing areas（Baoshan， Lincang and Dehong） in Yunnan were detected the molecular identification of five viruses， namely， Sugarcane mosaic virus（SCMV）， Sorghum mosaic virus（SrMV）， Sugarcane streak mosaic virus（SCSMV）， Sugarcane yellow leaf virus（SCYLV） and Sugarcane bacilliform virus（SCBV）， via PCR and RT-PCR methods. 【Result】A total of 89 out of the 113 sugarcane samples were detected viruses positive with a detection rate of 78.8%. The detected virus species were SrMV， SCSMV， SCYLV and SCBV， and the detection rates were 5.3%， 11.5%， 20.4% and 70.8% respectively. SCMV was not detected in all samples. Thirty samples were co-infected with different viruses， and the co-infection rate was 26.5%. Among them， twenty-seven samples were co-infected with two viruses， accounting for 23.9%， and three samples were co-infected with three viruses， accounting for 2.7%. No samples were co-infected with four or five viruses. 【Conclusion】The sugarcane virus diseases are caused by SrMV， SCSMV， SCYLV and SCBV in Yunnan. SCBV widely distributes in Yunnan， and SrMV， SCSMV and SCYLV also distribute in some parts of Yunnan. Co-infection with several viruses， especially two viruses， is common in sugarcane in Yunnan.

Key words： sugarcane; virus disease; molecular identification; Yunnan

0 引言

【研究意义】甘蔗（Saccharum spp.）是热带和亚热带地区重要的经济作物，不仅是食糖的主要来源，还可用于生产燃料乙醇（Tew and Cobill， 2008; Zhou et al.， 2016）。甘蔗在生长过程中会受到多种病原体尤其是病毒的侵染，长期无性繁殖留种使得病毒在甘蔗种质中不断积累，从而导致甘蔗品种退化、长势变差、产量和糖分降低，对甘蔗产业构成严重威胁（王明强等， 2010;徐正银等， 2014）。云南是我国重要的甘蔗产区，蔗糖产业是该地区经济发展和边疆脱贫致富的支柱产业（黄应昆等， 2007）。因此，了解云南地区甘蔗病毒性病害的发生情况，对该地区甘蔗病毒性病害的防治及云南乃至全国甘蔗产业的健康发展均具有重要的指导意义。【前人研究进展】甘蔗花叶病是一种全球性甘蔗病害，在各大甘蔗种植国家和地区普遍发生。甘蔗感染花叶病后会导致种苗的萌芽率降低、长势变差、产量减少10%～40%（黄应昆等， 2007）。引起甘蔗花叶病的主要病原包括甘蔗花叶病毒（Sugarcane mosaic virus，SCMV）、高粱花叶病毒（Sorghum mosaic virus，SrMV）和甘蔗线条花叶病毒（Sugarcane streak mosaic virus，SCSMV）。甘蔗黄叶病亦是一种全球性甘蔗病害，由甘蔗黄叶病毒（Sugarcane yellow leaf virus，SCYLV）引起。甘蔗感染SCYLV后即使未表现发病症状，其产量也会受到一定影响，发病严重时产量损失可高达50%（Lehrer et al.， 2008;Elsayed et al.， 2015）。甘蔗杆状病是近年新流行的一种甘蔗病毒性病害，由甘蔗杆状病毒（Sugarcane bacilliform virus，SCBV）引起，可导致甘蔗产量和品质下降（李文凤等， 2010;徐正银等， 2015）。甘蔗花叶病、黄叶病和杆状病是威胁我国甘蔗生产的主要病毒性病害，目前在云南地区已有这3种病害发生。李文凤等（2009）采用组织斑点免疫技术对采自云南省的表现症状或无症的甘蔗样品进行SCYLV检测，结果发现30份样品中有27份检出SCYLV。李文凤等（2010）采用PCR在云南甘蔗样品中检测到SCBV，对检测到的SCBV云南分离物部分序列进行分析，发现其与GenBank中已登录的澳大利亚和摩洛哥分离物对应核苷酸序列相似性分别为73.2%～74.0%和66.7%～68.4%，表明SCBV基因组具有高度变异性。Wang等（2012）采用RT-PCR对66份云南甘蔗样品进行SCYLV检测，结果发现28份样品呈阳性，检出率为42.4%;基因型分析结果顯示，28份阳性样品所感染的SCYLV均为BRA基因型。贺振（2014）采用RT-PCR对云南甘蔗花叶病样品进行检测，发现引起该地区甘蔗花叶病的病原有SCMV、SrMV和SCSMV，其中SrMV是主要病原;进一步分析发现当地甘蔗病毒复合侵染现象明显，多为SrMV与SCMV或与SCSMV复合侵染，零星存在SCMV与SCSMV复合侵染。周娅（2014）在云南甘蔗花叶病样品中也检出SCMV、SrMV和SCSMV 3种病毒，其中SrMV为主要病原。单红丽等（2016）对云南甘蔗花叶病样品的RT-PCR检测结果显示，SCSMV为主要病原，检出率为58.0%，SrMV次之，为49.4%，SCMV最低，为11.1%;存在病毒复合侵染现象，以SrMV与SCSMV复合侵染最常见。【本研究切入点】近年来关于云南地区甘蔗病毒性病害发生情况的报道较多，但这些报道均只针对一种病毒性病害，主要是甘蔗花叶病或甘蔗黄叶病，而对近年大规模流行的甘蔗杆状病的发生情况报道较少，未见多种病毒性病害综合发生情况的报道。【拟解决的关键问题】利用PCR或RT-PCR对云南甘蔗样品进行SCMV、SrMV、SCSMV、SCYLV和SCBV等5种甘蔗病毒分子鉴定，了解云南地区甘蔗花叶病、黄叶病和杆状病等常见甘蔗病毒性病害的综合发生情况，掌握其病原病毒种类和分布，为云南地区甘蔗病毒性病害的有效防治提供理论依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

2017年8—9月分别从云南保山、临沧和德宏3个甘蔗种植区采集显症或不显症的甘蔗叶片样品36、30和47份，合计113份。以本课题组前期采自田间并经PCR或RT-PCR鉴定染病的甘蔗叶片为阳性对照，灭菌双蒸水为空白对照。

1. 2 总RNA提取及cDNA合成

样品总RNA按照E.Z.N.A.R Plant RNA Kit（mega Bio-tek， USA）说明进行提取，提取的总RNA质量通过1%琼脂糖凝胶电泳分析。总RNA未经消化DNA直接用于合成cDNA，采用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（Thermo Scientific， UK）进行合成，其中以Random Hexamer primer为引物，6.0 μL总RNA为模板。

1. 3 PCR及RT-PCR扩增

PCR及RT-PCR扩增所用特异引物见表1，所有引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。扩增体系20.0 μL：模板0.5 μL，正、反引物（10 μmol/L）各0.5 μL，2×Taq Plus MasterMix（Biosharp，CN）10.0 μL，灭菌双蒸水补足至20.0 μL。扩增程序：94 ℃预变性5 min;94 ℃ 30 s，相应退火温度（表1）30 s，72 ℃ 1 min，进行35个循环;72 ℃延伸10 min。采用1%琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测分析。

1. 4 扩增产物序列分析

按照AxyPrepTM DNA Gel Extraction Kit（Axygen， US）说明对部分PCR或RT-PCR阳性扩增产物进行回收。回收产物由生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。采用NCBI的BLAST功能对测序结果进行分析。

2 结果与分析

2. 1 PCR或RT-PCR检测结果

用SCMV特异性引物对样品进行RT-PCR检测，结果显示，仅阳性对照扩增得到906 bp左右的目的条带，所有样品均无目的条带产生。用SrMV特异性引物对样品进行RT-PCR检测，结果显示部分样品扩增得到828 bp左右的目的条带;对阳性样品的扩增序列进行BLAST分析，发现其与来自云南、广西和海南等地SrMV分离物的相应核苷酸序列同源性高达98%～99%，表明其确为SrMV的基因片段序列。用SCSMV特异性引物对样品进行RT-PCR检测，结果显示部分样品扩增得到939 bp左右的目的条带;对阳性样品扩增序列进行BLAST分析，发现其与来自我国云南、海南及泰国等地SCSMV分离物的相应核苷酸序列同源性高达98%～99%，确定其为SCSMV的基因片段序列。用SCYLV特异性引物对样品进行RT-PCR检测，结果显示部分样品扩增得到588 bp左右的目的条带;对阳性样品扩增序列进行BLAST分析，发现其与来自云南、广东、海南和福建等地的SCYLV分离物的相应核苷酸序列同源性高达98%～99%，确定其为SCYLV的基因片段序列。用SCBV特异性引物对样品进行PCR检测，结果显示部分样品扩增得到589 bp左右的目的条带;对阳性样品扩增序列进行BLAST分析，发现其与来自我国云南及印度等地的SCBV分离物的相应核苷酸序列同源性高达90%～99%，确定其为SCBV的基因片段序列（图1）。

2. 2 云南甘蔗病毒种类分析

检测结果（表2）显示，113份甘蔗样品中有89份检出病毒，病毒检出率为78.8%，检出的病毒种类有SrMV、SCSMV、SCYLV和SCBV，未检出SCMV。其中，有6份样品检出SrMV，检出率为5.3%;13份样品检出SCSMV，检出率为11.5%;23份样品检出SCYLV，检出率为20.4%;80份样品检出SCBV，检出率为70.8%。

在云南不同地区采集的甘蔗样品检出的病毒种类和检出率也不同。在保山采集的36份样品中有30份检出病毒，病毒检出率为83.3%，检出的病毒种类有SCSMV、SCYLV和SCBV，未检出SCMV和SrMV;其中，检出SCSMV样品4份，占11.1%，SCYLV样品8份，占22.2%，SCBV样品28份，占77.8%。在临沧采集的30份样品中有26份检出病毒，病毒检出率为86.7%，检出的病毒种类有SrMV、SCSMV、SCYLV和SCBV，未检出SCMV;其中，检出SrMV样品4份，占13.3%，SCSMV样品7份，占23.3%，SCYLV样品8份，占26.7%，SCBV样品21份，占70.0%。在德宏采集的47份样品中有33份检出病毒，病毒检出率为70.2%，检出的病毒种类有SrMV、SCSMV、SCYLV和SCBV，未检出SCMV;其中，檢出SrMV和SCSMV样品各2份，各占4.3%，SCYLV样品7份，占14.9%，SCBV样品31份，占66.0%（表2）。

2. 3 云南甘蔗病毒复合侵染情况

由表3可知，113份样品中有24份未检出病毒，59份检出1种病毒，30份检出2种或3种病毒，即发生病毒复合侵染，复合侵染率为26.5%。发生病毒复合侵染的样品中有27份为2种病毒复合侵染，占23.9%，主要是SCYLV和SCBV复合侵染;3份发生3种病毒复合侵染，占2.7%，主要是SrMV、SCSMV和SCBV复合侵染。未发现4种或5种病毒复合侵染的现象。

不同地区采集的甘蔗样品病毒复合侵染情况略有不同。保山采集的36份样品中，6份未检出病毒，21份检出1种病毒，9份检出2种或3种病毒复合侵染，复合侵染率为25.0%;9份复合侵染的样品中有8份受2种病毒复合侵染，占22.2%，主要是SCYLV与SCBV复合侵染，1份受3种病毒复合侵染，占2.8%，为SCSMV、SCYLV与SCBV复合侵染。临沧采集的30份样品中，4份未检出病毒，13份检出1种病毒，其余的13份检出2种或3种病毒复合侵染，复合侵染率为43.3%;13份复合侵染的样品中有12份受2种病毒复合侵染，占40.0%，主要是SCYLV与SCBV复合侵染，1份受3种病毒复合侵染，占3.3%，为SrMV、SCSMV与SCBV复合侵染。德宏采集的47份样品中，14份未检出病毒，25份检出1种病毒，8份检出2种或3种病毒复合侵染，复合侵染率为17.0%;8份复合侵染的样品中有7份受2种病毒复合侵染，占14.9%，主要是SCYLV与SCBV复合侵染，1份受3种病毒复合侵染，占2.1%，为SrMV、SCSMV与SCBV复合侵染。

3 讨论

本研究利用PCR和RT-PCR对云南地区甘蔗样品进行SCMV、SrMV、SCSMV、SCYLV和SCBV等5种甘蔗病毒分子鉴定，结果显示，SCMV在所有样品中均未检出，检出率为0，其余4种病毒在云南地区的检出率分别为5.3%、11.5%、20.4%和70.8%。检测结果显示在引起甘蔗花叶病的3种病原中，SCSMV的检出率最高。贺振（2014）、周娅（2014）的研究结果均表明SrMV是云南地区甘蔗花叶病的主要病原;单红丽等（2016）的研究结果则显示在云南地区甘蔗花叶病样品中SCSMV的检出率高于SrMV和SCMV。本研究结果与单红丽等（2016）的研究结果一致，说明SCSMV已取代SrMV成为云南地区甘蔗花叶病的主要病原。据报道，引起云南地区甘蔗花叶病的3种病原中，SCMV的检出率最低，且其很少与SCSMV共同侵染甘蔗（贺振， 2014; 周娅， 2014;单红丽等， 2016）。本研究在云南地区所有甘蔗样品中均未检测到SCMV，推测SCMV与SCSMV存在竞争关系，SCSMV作为云南地区甘蔗花叶病的主要病原，可能严重抑制了SCMV对甘蔗的侵染。SCYLV在云南保山、临沧和德宏3个蔗区的检出率为14.9%～26.7%，说明SCYLV在云南地区具有一定程度的分布。SCBV在云南3个蔗区的检出率均在70.0%左右，说明SCBV在云南地区广泛分布。甘蔗受SCBV侵染后尽管症状表现不稳定，有时甚至出现隐性侵染，但其产量和品质仍会有所下降（李文凤等，2010）。因此，在甘蔗生产过程中务必要重视SCBV的防治工作。

对云南地区甘蔗样品的病毒复合侵染情况进行分析，结果显示，113份样品中有30份存在病毒复合侵染现象，复合侵染率为26.5%，其中2种病毒复合侵染现象明显，主要为SCYLV与SCBV复合侵染，3种病毒复合侵染现象零星发生，主要是SrMV、SCSMV与SCBV复合侵染，不存在4种或5种病毒复合侵染的现象。病毒复合侵染甘蔗的现象在我国各蔗区常有发生，如SCMV与SrMV复合侵染在江西（蒋军喜等，2009）、云南（贺振，2014）、广西（周丰静等，2015）等蔗区曾发生，SrMV与SCSMV复合侵染在云南等蔗区曾发生（贺振，2014），SrMV与SCYLV复合侵染在海南等蔗区曾发生（熊国如等，2011），SCMV、SrMV与SCYLV复合侵染在广西等蔗区曾发生（徐正银等，2014）。病毒复合侵染甘蔗的现象普遍存在，但在复合侵染过程中病毒间的关系如何、是否存在协同作用等问题尚不清楚，有待进一步探究。

本研究结果反映了甘蔗花叶病、黄叶病和杆状病等重要甘蔗病毒性病害在云南地区的发生情况，为合理制定云南地区甘蔗病毒性病害的防治策略提供了理论依据。

4 结论

目前云南地区甘蔗病毒性病害由SrMV、SCSMV、SCYLV和SCBV侵染引起;SCBV在云南地区广泛分布，SCYLV在云南地区有一定程度的分布;SrMV和SCSMV是引起云南地区甘蔗花叶病的2种病原，且以SCSMV为主;2种病毒复合侵染现象明显，主要为SCYLV与SCBV复合侵染，3种病毒复合侵染现象零星发生，主要是SrMV、SCSMV与SCBV复合侵染，未发现4种或5种病毒复合侵染的现象。

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