厚朴中蛋白质提取方法的优化

翁德会，杨文婷，汤雅萍，范承涛，刘翠，程勋

（1.武汉华夏理工学院生物与制药学院，湖北武汉430223；2.武汉工商学院环境与生物工程学院，湖北武汉430065）

厚朴为木兰科植物厚朴（Magnolia officinalis Rehd.et Wils.）或凹叶厚朴（Magnolia officinalis Rehd.et Wils.Var.biloba Rehd.et Wils.）的干燥干皮、根皮及枝皮，俗称“紫油厚朴”。味苦、辛、性温，归脾、胃、肺、以及大肠经，具有燥湿消痰，温中下气的功效，临床主要用于湿滞伤中，腕痞吐泻，腹胀便泻，痰饮咳喘以及食积气滞等[1]。其主要产地位于四川、浙江、广西、湖北、湖南等地。在中成药中，采用厚朴配方的多达200多种，不同产地厚朴其性状和有效成分含量有一定区别。现今对不同产地厚朴的鉴定研究多集中在DNA提前和分析、不同化学成分如木脂素、挥发油等含量分析方面，对蛋白质提取分离及电泳指纹图谱研究较少[2-3]。

蛋白质电泳指纹图谱的构建前提是需从样品中提取高质量高含量的蛋白质，故厚朴中的蛋白质提取是其蛋白质电泳指纹图谱研究中重要的一环。本研究对厚朴中的蛋白质进行提取鉴定，取以静置过夜、超声清洗仪超声提取、超声破碎法3种不同的方法提取蛋白质[4-5]，通过考马斯亮蓝法测定其蛋白质含量，继而得到提取蛋白质含量最高、效率最高的方法。再通过单因素试验以及正交试验得到厚朴蛋白质提取方法的最佳条件，为利用聚丙烯酰胺凝胶电泳法进行不同产地厚朴的鉴别鉴定提供研究基础[6-7]。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

厚朴：湖北省恩施中药材生产规范示范基地，经湖北中医药大学鉴定教研室张林碧教授鉴定为木兰科植物厚朴的干燥树皮、根皮和枝皮。

牛血清白蛋白、考马斯亮蓝G-250：厦门星隆达化学试剂有限公司；磷酸、磷酸氢二钾（分析纯）：天津市天力化学试剂有限公司。

1.2 主要仪器与设备

DG120型粉碎机：浙江省瑞安市飞达药材器械厂；JY91-2D超声波细胞粉碎机：宁波新芝生物科技股份有限公司；GL-21M高速冷冻离心机：湘麓离心机仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 试验材料的预处理

将不同产地的厚朴于粉碎机中粉碎，过60目筛，收集粉末，装于不同的自封袋中，放置于4℃中冷藏。

1.3.2 牛血清白蛋白标准曲线的绘制

称取一定量的牛血清白蛋白粉末，配制成200 μg/mL的牛血清蛋白溶液，用移液管分别取5 mL考马斯亮蓝G250染液于试管中，分别加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL配制好的牛血清蛋白溶液，添加蒸馏水至溶液总体积6 mL。静置5 min，在10 min内测量吸光度，以蛋白质浓度（μg/mL）为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制牛血清白蛋白的标准曲线[8]。

1.3.3 3种方法提取厚朴蛋白质的比较

分别以冷浸法、超声清洗仪提取法、冰浴超声破碎法提取厚朴的蛋白质。取厚朴样品3份，每份1 g，分别加入缓冲液16 mL提取样品中蛋白质，冷浸法提取12 h，超声清洗仪100 W提取30 min，在超声破碎仪功率150 W、超声间隔时间8 s的条件下处理样品20 min。每种方法做3次平行试验，取浸提液0.1 mL采用考马斯亮蓝法测量吸光度，取平均值，以确定厚朴的蛋白质提取的合适方法[9-11]。

1.3.4 单因素试验

1.3.4.1 超声破碎时间对厚朴提取液蛋白质浓度的影响

控制超声功率150 W，超声破碎间隔8 s，取不同的超声时间 10、20、30、40、50 min 提取蛋白质，经考马斯亮蓝法测得其浸提液中蛋白质浓度。

1.3.4.2 超声功率对厚朴提取液蛋白质浓度的影响

控制超声时间30 min，超声破碎间隔8 s，取不同的超声功率 100、150、200、250、300 W 提取蛋白质，经考马斯亮蓝法测得其浸提液中蛋白质浓度。

1.3.4.3 超声破碎间隔时间对厚朴提取液蛋白质浓度的影响

控制超声时间30 min，超声功率150 W，取不同的超声间隔时间12、10、8、6、4 s提取蛋白质，经考马斯亮蓝法测得其浸提液中蛋白质浓度。

1.3.5 正交试验设计

在单因素试验的基础上，选用超声破碎时间（30、40、50 min），超声功率（200、250、300 W），超声破碎间隔时间（4、6、8 s）3个因素，每个因素设 3个水平，采用三因素三水平的正交试验设计L9（33），见表1。

表1 正交试验因素及水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test

2 结果分析与讨论

2.1 牛血清蛋白标准曲线的绘制

根据1.3.2中方法测定不同浓度下的牛血清蛋白溶液的吸光度，绘制标准曲线，见图1。

图1 牛血清白蛋白的标准曲线Fig.1 Standard curve of bovine serum albumin

如图1所示，标准曲线方程为A=0.004 9C+0.015 2，R2=0.997 2，表明在 0～200 μg/mL 浓度范围内，线性关系良好。

2.2 3种方法提取厚朴蛋白质的比较

3种不同蛋白质提取方法的蛋白质提取浓度见表2。

表2 3种不同蛋白质提取方法的比较Table 2 Comparison of three different protein extraction methods

由表2可知，3种不同蛋白质提取方式中，以超声破碎法提取厚朴蛋白质效果最佳，提取的蛋白质浓度在3种提取蛋白质的方法中最高，综合考虑，确定超声破碎法进一步进行提取条件的优化。

2.3 单因素试验

2.3.1 超声破碎时间对厚朴提取液蛋白质浓度的影响

在超声功率150 W，超声破碎间隔8 s的条件下，考察不同超声破碎时间对蛋白提取率的影响结果见图2。

图2 超声破碎时间对蛋白质提取浓度的影响Fig.2 Effect of ultrasonic time on the protein extraction concentration

由图2可知，蛋白质溶解于提取液是一个缓慢的过程，超声破碎时间从10 min～40 min，蛋白质提取率升高，当超声破碎时间为30 min，厚朴蛋白的提取率达到最大为880.11 μg/mL，再随着超声时间延长，蛋白质提取率呈现降低趋势，分析原因，可能是由于一定时间后，蛋白的溶出达到饱和，则溶出率趋于平衡，若再进一步延长浸提时间，可能是厚朴纤维素、淀粉等与蛋白质发生结合，使蛋白质难以溶出，从而使提取率降低，且超声破碎时间过长，样品易受微生物污染，影响蛋白产品的质量。因此选择超声破碎时间30 min为最佳条件。

2.3.2 超声功率对厚朴提取液蛋白质浓度的影响

在超声时间30 min，超声破碎间隔8 s条件下，超声功率对厚朴蛋白提取率的影响结果见图3。

图3 超声破碎功率对蛋白质提取浓度的影响Fig.3 Effect of ultrasonic power on the protein extraction concentration

由图3可知，当超声功率为250 W时，提取到的厚朴蛋白最高，为840.41 μg/mL。当超声功率小于250 W时，厚朴蛋白浓度随功率增加而增加，说明功率越高，蛋白质的提取率越高，蛋白质浓度也越高；而当超声功率大于250 W时，厚朴蛋白质的浓度开始降低，说明功率过大虽然会增加细胞破碎率，但由于功率增大的同时对活性物质的破坏力也有所增大，同时考虑到节约能源，因此超声功率选择250 W较为适宜。

2.3.3 超声间隔时间对厚朴提取液蛋白质浓度的影响

超声间隔时间是超声破碎过程中的重要因素之一，其直接影响细胞破碎率，而且不同时间间隔还会引起超声破碎过程中热效应和空化效应的改变，影响蛋白质的活性，控制超声时间30 min，超声功率250 W条件下，超声间隔时间分别以4、6、8、10、12 s进行超声细胞破碎，见图4。

图4 超声间隔时间对蛋白质提取浓度的影响Fig.4 Effect of ultrasonic interval time on the protein extraction concentration

由图4可知，在一定范围内，随着超声破碎间隔时间的增大，厚朴蛋白质浓度逐步减小，在超声破碎间隔时间为4 s时，厚朴蛋白质浓度最高，为862.86 μg/mL，之后蛋白质浓度呈下降趋势。在超声破碎间隔时间为4、6、8 s时，蛋白质浓度下降不明显，而在8 s到10 s蛋白质浓度影响较大，可能是因为超声破碎时间间隔过长会影响其破壁效果，使蛋白质无法充分溶出。考虑到超声破碎时间间隔过短会影响到仪器的使用寿命，因此，选择超声破碎间隔时间6 s进行超声破碎。

2.4 正交试验

2.4.1 正交试验结果分析

正交试验方案及结果见表3。

表3 正交试验方案及结果Table 3 Orthogonal test scheme and results

由表3可以看出，超声破碎提取厚朴蛋白质正交试验结果中，极差的高低顺序为：破碎时间>间隔时间>超声功率，即超声破碎时间对提取厚朴蛋白质的影响最大，其次是超声破碎间隔时间，影响最小的因素是超声破碎功率。由表3还可见，从厚朴提取蛋白质的最佳超声破碎工艺条件为，即超声功率250 W，超声破碎时间30 min，超声间隔时间6 s。即取1 g厚朴蛋白质粉末，加入4 mL稀释4倍的浓缩胶缓冲液，在250 W的超声功率下，取超声间隔间隔6 s，超声破碎30 min。

2.4.2 验证性试验

根据正交试验得出的最佳条件提取3次，取3份厚朴粉末，进行3次平行试验，测得蛋白质浓度分别为930.87、934.21、933.15 μg/mL，RSD 值为 0.18%，说明该条件下所得的蛋白质浓度基本稳定，条件可行。

3 结论

通过比较3种不同方式提取蛋白质的效率，确定超声破碎法提取为最佳。试验过程中发现用超声清洗仪超声破碎时其温度会随着超声时间的增加而增加，这可能会使蛋白质因温度的升高而变性失活，因此在冰浴条件下进行超声破碎能避免这一问题。蛋白质的提取是蛋白质指纹图谱构建中重要的一环，供试样品的蛋白质含量不能达到要求的话在电泳之后就无法得到清晰完整的条带[12-13]。在前期相关研究中，因提取样品的蛋白质含量过低，无法跑出达到清晰的电泳图谱，故在本研究中对超声破碎提取蛋白质的方法进行了优化，选择超声破碎时间、超声时间间隔以及超声破碎功率等因素，进行单因素试验和正交试验，继而得出最佳的蛋白质提取方式。结果表明，在超声破碎时间30 min，超声间隔时间6 s，超声破碎功率250 W时蛋白质提取浓度达到最大为930 μg/mL，达到了蛋白质电泳的灵敏度要求，为后续进行厚朴的蛋白质指纹图谱研究提供了研究基础。