呼伦贝尔市首例羊源荚膜D群多杀性巴氏杆菌的分离与鉴定

王 巍，乌云塔娜，格根塔娜，刘连发，田宗民，邱 凯，苏日古格，贾长生，王冠玉，赵忠武

（1.内蒙古呼伦贝尔市兽医科学研究所，呼伦贝尔 021000；2.新巴尔虎右旗动物疫病预防控制中心，新巴尔虎右旗 021300；3.海拉尔区动物疫病预防控制中心，海拉尔 021000）

多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida，Pm）感染能够引起动物多种疾病，包括牛出血性败血症、羊地方性流行性肺炎、猪萎缩性鼻炎、禽霍乱等，并可以引起人类疾病[1,2]。Pm呈世界性分布，对动物的致病率和死亡率均较高。根据荚膜抗原和脂多糖的不同，可将多杀性巴氏杆菌（Pm）分为5个血清群（A、B、D、E、F）和16个血清型（1～16）。我国有A、B、D 3个血清群，其中猪以5∶A型、6∶B型为主，牛羊以6∶B型最多，家禽以5∶A最多[3]。Pm不同荚膜血清型菌株之间交叉保护率较低，且各菌株在流行病学、毒力、生物学特征等方面的差异显著[4]，因此准确快速地鉴定荚膜血清型以及找到地方性流行株的敏感药物是预防和控制巴氏杆菌病的关键。

羊巴氏杆菌病又称羊鼻疽、羊出血性败血症，常呈地方流行，多发生于春、秋季节[5,6]。内蒙古呼伦贝尔是我国养羊产业重点地区之一，随着羊养殖业的快速发展，全市羊巴氏杆菌病的发病率呈上升趋势，给养殖业造成巨大经济损失。本研究以呼伦贝尔市地区鄂温克旗两个羊场出现的体温升高、精神沉郁、食欲废绝、颈向前伸、咳嗽、腹泻、鼻孔有出血甚至死亡的病羊为研究对象，采集病变组织，利用细菌常规培养鉴定技术[7,8]和Townsend等[9]建立的多杀性巴氏杆菌定种的PCR鉴定方法，鉴定多杀性巴氏杆菌及其荚膜血清型，并进行药敏试验找到针对流行株的敏感药物，为本地区羊呼吸道疾病病原种类的确定、研制针对性疫苗以及诊断技术的研究提供依据和参考。

1 材料与方法

1.1 病料来源 2份羊肺组织病料均采集自呼伦贝尔市鄂温克族自治旗，编号EY1，EY2。

1.1.1 临床症状 EY1为2017年5月送检的病死种公羊。其来源的羊场已死亡7只羊，部分病羊主要表现体温升高、精神沉郁、食欲废绝、颈向前伸、咳嗽、腹泻、鼻孔有出血、眼结膜潮红、有的颈部发生水肿，病程为2～5 d。个别羊突然发病，全身寒战、虚弱、呼吸困难并伴有抽搐等症状，数小时内死亡。EY2为2017年7月送检病死羊，其来源的羊场已死亡30只左右，病羊主要表现体温升高、精神沉郁、食欲废绝、腹泻、口中有白沫，用驱虫、退烧药等均无效。

1.1.2 剖检变化 通过对送检病羊进行剖检，EY1呈急性死亡，器官病变不明显。EY2可见胸腔内有黄色积液，肺淤血、充血、水肿、有小出血点和肝变，脾脏肿大且边缘不齐，胃肠道有出血性炎症；心脏苍白、质地柔软。

1.2 试剂 酵母提取粉、胰蛋白胨均购自广东环凯微生物科技有限公司；革兰氏染色液、瑞士染色液购自南京建成科技有限公司；DNA Marker2000、HotMaster Taq DNA Polymerase、细菌基因组 DNA提取试剂盒均购自天根生化科技（北京）有限公司；抗菌药物药敏纸片购自杭州微生物试剂有限公司。

1.3 实验室镜检 取新鲜无菌病死羊肺组织进行涂片、干燥、固定，用革兰氏染色法和瑞士染色法染色镜检，观察形态特征。

1.4 细菌培养 取新鲜无菌病料划线接种于LB血琼脂平板固体培养基，37℃培养24 h，观察菌落生长情况，并将疑似菌落进行染色镜检。同时取新鲜无菌病料划线接种于麦康凯培养基。

1.5 细菌DNA提取 挑取LB血琼脂平板上单个菌落，接种于5%胎牛血清LB液体培养基中，37℃ 200r/min，震荡孵育18～24 h；取2 mL培养菌液 2500×g离心10 min，弃上清；采用细菌DNA提取试剂盒进行DNA提取。

1.6 Pm双重PCR鉴定 参考Townsend等[9]合成的Pm种特异性基因KMT1引物以及A 群、B群、D群、E群、F群的荚膜血清型特异性基因引物（表1），引物由北京华大基因生物技术服务有限公司合成。将提取的肺组织基因组 DNA 作为 PCR 扩增的模板，先用鉴定巴氏杆菌引物KMT1扩增待检样品，然后利用鉴定其荚膜血清型引物capA、capB、capD、capE、capF进行双重PCR，扩增目标序列。两轮PCR反应体系及条件一样，采用50 μL反应体系：其中上下游引物各2 μL，10×PCR Buffer 5μL，dNTP Mixture（2.5 mmol/L） 4 μL，ddH2O 34.5 μL，Taq DNA Polymerase（5 U/μL）含MgCl20.5 μL，DNA模板2 μL。反应条件：95℃预变性5 min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，30个循环；72℃延伸5 min。

表1 巴氏杆菌特异引物序列Table 1 The Pm primers

1.7 序列测定和进化树分析 阳性样品送吉林库美生物技术有限公司测序鉴定，结果与GenBank发表的多杀性巴氏杆菌进行比对分析。搜索GenBank中已提交多杀性巴氏杆菌序列，应用BioEdit软件与样品序列比较，MEGA5.0软件绘制进化树进行同源性分析。

1.8 药敏试验 药敏试验参照国家检验操作规程采用纸片琼脂扩散法，又称圆通平板法[10]。把经过24 h纯培养的分离到的巴氏杆菌培养物进行10倍稀释，并在鲜血琼脂平板上进行接种，按照0.2 mL对每个平板进行接种，并涂抹均匀。在保持纸片间的适当距离的基础上，用经过消毒后的无菌镊子把各药敏片按顺序平铺于培养基表面，放置于37℃温箱内培养24 h。药物选择参照呼伦贝尔市羊病常用药物及文献[11-13]，判定方法参照杭州微生物试剂有限公司药敏纸片判断标准，观察结果并测量抑菌圈直径。

2 结果

2.1 菌株形态特征和生长特性 病料革兰氏染色镜检可见两端钝圆、两极着色的阴性短杆菌；瑞士染色无鞭毛及芽孢，荚膜显著。病料分离菌株在血平板上生长良好，呈清亮、淡灰白色、闪光的露珠状，湿润黏稠样，菌落周围不溶血。在普通LB琼脂培养基上生长贫瘠，在麦康凯琼脂培养基上不生长。

图1 分离菌株血平板培养及革兰氏、瑞氏染色结果Fig.1 Results of isolated bacterial Gram stain and Wright’s stain

2.2 双重PCR鉴定结果 Pm种特异性基因KMT1引物扩增出460 bp片段（图A），用Pm 种特异性基因KMT1引物分别和A 群、B群、D群、E群、F群的荚膜血清型特异性基因引物进行双重PCR扩增，只有KMT1和D群引物扩增出近460 bp和648 bp的2条特异性条带，而KMT1和A群、KMT1和B群、KMT1和E群、KMT1和F群都只扩增出1条460 bp的特异性条带（图B）。

图2 培养Pm的PCR（A）以及血清型鉴定（B）结果Fig.2 Results of PCR(A) and serotype identification of isolated Pm

2.3 测序结果比对和遗传进化分析 本研究扩增的特异性基因KMT1的序列与Genbank中巴氏杆菌印度株（登录号：KY825087）同源性高达100%，与KX348143、KX449351、CP023305同源性高达99%，可以判断分离培养菌为多杀性巴氏杆菌；扩增的荚膜血清型特异性基因序列与GenBank中巴氏杆菌AF439804、AF302465、CP003313同源性高达99%，可以判断分离培养菌为多杀性巴氏杆菌荚膜血清D群。

2.4 药敏试验结果 药敏试验如表2，分离菌株对青霉素、复方新诺明、克林霉素耐药，对诺氟沙星、卡那霉素、环丙沙星等药物均不敏感。

3 讨论

图3 培养菌株KMT1基因遗传进化分析Fig.3 KMT1 gene phylogeny analysis of isolated strains

多杀性巴氏杆菌可以引起多种动物和人类疾病，是一种人畜共患病原。在国内多杀性巴氏杆菌是引起绵羊及山羊呼吸道疾病的常见病原，由于广泛存在于羊的各个生长阶段，经常导致羊生长性能降低甚至死亡，给养羊业带来巨大损失，尤其近年来养羊业呈快速集约化发展，国内外引种不断加大，各地区羊只频繁调动流通，巴氏杆菌病暴发也与日俱增。因此定期进行预防接种，增强机体对该病的特异性免疫力才是防控巴氏杆菌病发生最有效最直接的方法，但由于多杀性巴氏杆菌存在A、B、D、E、F共5个荚膜血清群，各血清型之间大多无交叉免疫原性，某型菌株疫苗只对同型有较好的保护作用，致使在临床上预防Pm的传统疫苗效果不佳[14-15]，因此调查研究本地区流行的荚膜血清型、研制针对羊某型Pm的疫苗对防治羊呼吸道疾病，减少经济损失十分迫切。

本研究正是利用双重PCR方法对Pm进行荚膜血清型鉴定，通过结果分析表明2株羊源Pm均为荚膜血清D群。经序列比对及遗传进化树分析，EY1、EY2与印度分离株同源性高达100%。药敏试验结果表明分离菌株对氯霉素、氟氧沙星、哌拉西林等药物敏感，对青霉素、复方新诺明、克林霉素已耐药，对诺氟沙星、卡那霉素、环丙沙星等药物已不敏感。笔者通过走访得知有关羊呼吸系统疾病的抗感染失败的现象已屡见不鲜，多数病例对常用抗菌药物表现抗性，呈反复发病，最终导致治疗失败，死亡率增加，这与羊场长期大剂量的使用抗生素治疗不无关系。本研究临床分离的D群Pm不仅为研制相应的疫苗及科学防治巴氏杆菌病提供依据，同时对Pm疾病暴发的流行病学监测和基因多样性研究奠定了基础。但限于收集的细菌株有限，有待对呼伦贝尔地区Pm进一步监测流调，找到本地区流行的荚膜血清型，为有效防控该地区羊巴氏杆菌病提供科学依据，进而提高养殖业经济效益。