五氯苯酚(PCP)是一种有毒农药,常用于木材防腐、杀真菌、杀虫等。我国曾大量将五氯酚酸钠(PCP-Na)用于杀灭钉螺。同时五氯酚酸钠也为触杀型灭生性除草剂,主要用于防除稗草和其他多种由种子萌发的幼草。
五氯酚酸钠可由呼吸道、消化道以及皮肤进入人体,在酸性条件下转化为五氯苯酚,微量的五氯苯酚即可导致人体中枢神经系统、肝、肾损伤及内分泌紊乱。《动物性食品中兽药最高残留限量》规定:五氯酚酸钠禁止使用于食品中。
鸡蛋作为一种营养价值高,蛋白质含量丰富的食品,深受人们的喜爱。蛋黄主要由卵黄磷蛋白组成,脂肪含量高,其中脂肪主要为卵磷脂,磷脂具有非常好亲水性。国标GB 29708的前处理方法无法有效除去鸡蛋中的磷脂,使试样中含有大量脂肪,不仅降低了目标物的提取效率,还极易污染检测设备,给五氯酚酸钠的检测带来了较大困难。
试剂与仪器
五氯酚酸钠标准溶液100μg/mL(曼哈格);甲醇 (迪马公司,色谱纯);衍生试剂(乙酸酐:吡啶=1:1);0.2mol/L碳酸钾水溶液;5%三氯乙酸水溶液;浓盐酸;浓硫酸。
实验室用水都为超纯水。
Agilent 7890B-Agilent 7000C气质联用仪(配置EI源);Millipore超纯水机;西格玛高速离心机;漩涡混合器;分析天平(感量0.1mg);恒温干燥箱;氮吹仪;50mLPPOC高速离心管。
方法
标准溶液的配制
精密吸取五氯酚酸钠标准溶液0.1mL,于10mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度,配制成浓度为1μg/mL的五氯酚酸钠标准储备液,-20℃以下保存。
取适量的1μg/mL五氯酚酸钠标准储备液,用水配制成浓度为10、20、40、60、80、100ng/mL标准系列工作液。
样品液的制备
准确称取混合均匀的试样2.00g于50mL具塞离心管中,加入5%三氯乙酸溶液(3.9)10mL、浓盐酸0.5mL和正己烷10mL,高速涡旋提取1min,8000r/min离心5min,收集有机层于50mL离心管中。再用20 mL正己烷分2次洗涤残渣,合并有机层,再向有机相中加入浓硫酸0.5mL,小心振摇,静置2min,8000r/min离心5min,收集上清液,于45℃氮气吹至近干。残余物中加入正己烷1.0mL,加入乙酸酐-吡啶溶液0.2mL,密封,于60℃反应15min,冷却,加碳酸钾溶液0.5mL,充分混匀,静置分层,取有机相,供气相色谱质谱仪测定。同时用空白样品做空白实验。
实验条件
色谱柱:HP-5MS(30m×0.25mm×0.25μm);
升温程序:60℃保持1min,以15℃/min升温到280℃保持10分钟。
进样方式:不分流进样;
不分流时间:0.75min;
进样量:1μL;
进样口温度:260℃
载气:氦气(99.999%);
恒流模式:1mL/min;
离子源温度:280℃;
传输线温度:280℃;
扫描模式:选择离子检测,检测离子(m/z):266(定量),308,237,165,130。
实验原理
GB 29708-2013使用水提取试样中的五氯酚酸钠,三氯乙酸脱蛋白。五氯酚酸钠在酸性条件下转化为五氯苯酚,使用乙酸乙酯-环己烷(1︰1)提取五氯苯酚,后经衍生,生成五氯苯乙酸酯(PCP-OAc),使用气质联用仪测定PCP-OAc的含量,来获得五氯酚酸钠的含量。
鸡蛋中除丰富的蛋白质外,卵黄中还含有大量的磷脂,磷脂具有较好的亲水性和脂溶性,无法使用GB 29708的前处理方法除去。而五氯苯酚在脂肪中的溶解度较大,要保证检测的灵敏度和准确度,就必然带入大量的磷脂,过量的磷脂将严重影响衍生效果和污染检测设备。本方法直接使用正己烷提取,简化了提取操作。在衍生前,通过加入浓硫酸来脱去脂肪,排除磷脂产生的不良影响,提高了检测效率,保证了灵敏度和准确度。该方法也可用于其他脂肪含量高的样品中五氯酚酸钠的测定。
标准曲线
分别取浓度为10、20、40、60、80、100ng/mL的标准工作液1.0mL,置于50mL离心管中,以下操作步骤同样品溶液的制备。以特征离子质量色谱图峰面积为纵坐标,标准溶液浓度为横坐标,绘制标准曲线。求回归方程和相关系数。标准物质色谱图质谱图见图1,标准曲线见图2。
图1 PCP-Oac的色谱图(上)和质谱图(下)
图2 标准曲线
回收率和精密度实验
鸡蛋的称样量为2.00g,添加浓度为5µg/kg,20μg/kg,50μg/kg三个水平,各做三个平行样,标准物质、样品加标和样品图谱见图4,测定结果和精密度见表1。
图3 样品图谱(自上而下依次为标准溶液、样品加标、空白样品)
表1 加标回收率和精密度
由图3可见,净化效果良好,且对检测没有干扰。本方法在鸡蛋中的加标浓度为5µg/kg时,回收率为109%,重复性RSD为3.6%;加标浓度为20µg/kg时,回收率为109%,重复性RSD为2.9%;加标浓度为50μg/kg时,回收率为113%,重复性RSD为4.1%,以上数据表明该方法检测鸡蛋中的五氯酚酸钠稳定可靠。方法检出限以3倍信噪比计算得到,本方法测定鸡蛋中五氯酚酸钠的检出限为0.5μg/kg。
图4 样品加标量为5μg/kg的提取离子流图
鸡蛋中的五氯酚酸钠在酸性条件下,经正己烷提取,浓硫酸脱脂,衍生后经气质联用仪测定确认,外标法定量。结果表明:本法五氯酚酸钠的回收率为106.1%-118.4%,平行测定结果的RSD值≤5%,方法检出限为0.5μg/kg,能够满足鸡蛋中五氯酚酸钠残留量的检测要求。同时该方法也拓展到其他脂肪含量高的样品中五氯酚酸钠的测定。