苗药大乌泡茎乙醇提取物的化学成分研究

杜士杰 周郭宁 杨来娣 王兆岩

中图分类号 R284.1 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2018）12-1644-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.12.14

摘 要 目的：研究苗药大乌泡茎乙醇提取物的化学成分。方法：采用硅胶柱、制备液相色谱、Sephadex LH-20凝胶柱等对大乌泡茎乙醇提取物进行分离纯化，根据理化性质和波谱（质谱、氢谱、碳谱）数据分析鉴定化合物結构。结果：从大乌泡茎乙醇提取物中分离得到10个化合物，分别鉴定为5，4′ -二羟基-8-（3，3-二甲基烯丙基）-2″ ，2″ -二甲基吡喃[5，6 ∶ 6，7]异黄酮（1）、3-羟基-1-（4′ -羟基-3′ -甲氧基苯）-1-丙酮（2）、3β-羟基豆甾-5-烯-7-酮（3）、羽扇豆醇（4）、松柏醛（5）、反式对羟基肉桂酸（6）、染料木黄酮（7）、1-O-对羟基肉桂酰单甘油酯（8）、东莨菪内酯（9）、山柰酚（10）。结论：化合物1～9均为首次从大乌泡植物中分离得到，化合物2、5、8为首次从悬钩子属植物中分离得到。该研究可为大乌泡的进一步开发利用奠定基础。

关键词 苗药；大乌泡；茎；乙醇提取物；化学成分；结构鉴定

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the chemical constituents in ethanol extract from the stem of Miao medicine Rubus multibracteatus. METHODS： The ethanol extract from the stem of Miao medicine R. multibracteatus was isolated and purified by silica gel column， preparative liquid chromatography and Sephadex LH-20 gel column， etc. The structure of compounds were analyzed and identified according to physicochemical properties and spectrum data （MS， hydrogen spectrum and carbon spectrum）. RESULTS： Ten compounds were isolated from the ethanol extract of R. multibracteatus stem， i.e. 5，4′-dihydroxy-8-（3，3-dimethylally）-2″ ，2″ -dimethylpyrano [5，6 ∶ 6，7] isoflavone（1），3-hydroxy-1-（4′-hydroxy-3′-methoxyphenyl）propan-1-one（2），3β-hydroxysitost-5-en-7-one（3），Lupeol（4），Coniferaldehyde（5），E-p-hydroxy-coumaric acid（6），Genistein（7），1-O-p-coumaroylglycerol（8）， Scopoletin（9）， and Kaempferol（10）. CONCLUSIONS： Compound 1-9 are isolated from the plants of R. multibracteatus for the first time， and Compound 2， 5， 8 are isolated from the plants of Rubus L. for the first time. The study lays the foundation for further development and utilization of R. multibracteatus.

KEYWORDS Miao medicine； Rubus multibracteatus； Stem； Ethanol extract； Chemical constituent； Structure identification

大乌泡（Rubus multibracteatus Levl. et Vant.）又名乌袍、六月泡、倒生根、牛毛泡刺，为蔷薇科悬钩子属（Rubus L.）的一种落叶灌木[1]。该植物分布于我国鄂、湘、滇、川、贵等地区，生长于海拔500～3 000 m的山坡、林缘或灌丛中，全株皆可入药，其味苦、性凉，入脾、肝二经，具有清热解毒、凉血、止血、祛风除湿及接骨等功效[2]。大乌泡为常用苗药，是上市中药制剂龋齿宁含片中的一味重要药材，主要用于治疗龋齿痛及牙周炎[3]。相关研究显示，大乌泡地上部分水提物对小鼠具有良好的镇痛效果[4]，且其叶高极性粗提物的镇痛效果更佳[5]。此外，大乌泡叶提取物对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和白色念珠菌等病原菌均具有体外抑制作用[6]。民间常针对不同病症使用大乌泡的不同部位，如清热解毒多以叶入药，而治疗痢疾和倒经则以根、茎入药[3，7]，可见该植物不同部位所含的化学成分及其药理活性有所差异。但目前关于大乌泡化学成分的系统研究还十分有限，仅有少数研究证实其含有氨基酸、多糖和维生素等成分，并从大乌泡叶中分离出了山柰素-3-O-β-D-葡萄糖苷等8个化合物[7-8]。故为更好地研究和利用大乌泡这一宝贵的苗药资源，并为其后续活性成分及基础研究提供参考，本课题组对大乌泡茎的乙醇提取物进行了化学成分研究，现报道如下。

1 材料

1.1 仪器

BrukerAV型400 MHz核磁共振仪（瑞士Bruker公司）；Technologies 6120 Quardrapole型液质联用（LC-MS）仪（美国Agilent公司）；X4型显微熔点测定仪（北京中仪博腾科技有限公司）；LC-20A型高效液相色谱仪、LC-20AT型制备液相色谱仪（日本Shimadzu公司）；RE-52A型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；YOKO-BF-Ⅲ型薄层电动涂敷器（武汉药科新技术开发有限公司）。

1.2 试剂

Sephadex LH-20凝胶（40～120 μm，美国Amersham Biosciences公司）；C18反相色谱柱填料（75～150 μm，美国Merck公司）；GF254薄层硅胶板及柱色谱用硅胶（100～200、200～300目）（青岛海洋化工有限公司）；甲醇、乙腈为色谱纯，石油醚、乙酸乙酯、甲醇、乙醇等为分析纯，水为蒸馏水。

1.3 药材

试验药材由笔者于2016年10月采于贵州省铜仁市川硐镇，由铜仁学院材料与化学工程学院鲁道旺教授鉴定为悬钩子属（Rubus L.）大乌泡（Rubus multibracteatus Levl. et Vant.），标本（编号：WLTRCW20161015）保存于铜仁学院天然产物标本室。

2 提取与分离

取大乌泡茎30 kg，自然阴干后，粉碎成粗粉。取上述粗粉4.3 kg，经90%乙醇室温浸提2次（每次10 L，每次浸提时间为7 d），残渣用90%乙醇加热回流提取24 h，醇提液减压回收，得乙醇提取物浸膏623 g。将浸膏用蒸馏水1.5 L分散溶解，依次用等体积的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取各3次，合并相同溶剂萃取液，减压浓缩得到石油醚部位浸膏78.3 g、乙酸乙酯部位浸膏72.6 g、正丁醇部位浸膏90.4 g。

取石油醚部位浸膏50 g，经硅胶（100～200目）柱，以石油醚-乙酸乙酯（100 ∶ 0、100 ∶ 1、50 ∶ 1、30 ∶ 1、20 ∶ 1、10 ∶ 1、5 ∶ 1、2 ∶ 1、1 ∶ 1、1 ∶ 2、1 ∶ 5、0 ∶ 1，V/V）梯度洗脱，经薄层色谱法（TLC）鉴别后合并，得6个流分（Fr.1～Fr.6），对Fr.3、Fr.4进行细分，反复以上述混合溶液梯度洗脱，分别得到化合物1（17 mg）和化合物2（25 mg）。

取乙酸乙酯部位浸膏70 g，经硅胶（100～200目）柱，以石油醚-乙酸乙酯（100 ∶ 0、100 ∶ 1、30 ∶ 1、20 ∶ 1、10 ∶ 1、7 ∶ 1、5 ∶ 1、3 ∶ 1、2 ∶ 1、1 ∶ 1、1 ∶ 3、1 ∶ 5、0 ∶ 1，V/V）梯度洗脱后，再以乙酸乙酯-甲醇（20 ∶ 1，V/V）洗脱，洗脱液每2 L合并浓缩1次，经TLC法鉴别后合并，得13个流分（Fr.7～Fr.19）。其中，Fr.9经硅胶（200～300目）柱，以石油醚-乙酸乙酯（50 ∶ 1、20 ∶ 1、10 ∶ 1、5 ∶ 1、2 ∶ 1，V/V）梯度洗脱，得11个亚流分（Fr.9A～Fr.9K）。其中，Fr.9A、Fr.9C、Fr.9D、Fr.9G、Fr.9J经制备液相色谱、Sephadex LH-20凝胶柱纯化，分别得到化合物3（17 mg）、化合物4（12 mg）、化合物5（9 mg）、化合物6（26 mg）和化合物7（18 mg）。Fr.11经硅胶（200～300目）柱，以石油醚-乙酸乙酯（50 ∶ 1、20 ∶ 1、10 ∶ 1、5 ∶ 1、2 ∶ 1，V/V）梯度洗脱，得7个亚流分（Fr.11A～Fr.11G）。其中，Fr.11B、Fr.11D、Fr.11F经制备薄层色谱、半制备液相色谱和Sephadex LH-20凝胶柱纯化，分别得到化合物8（13 mg）、化合物9（22 mg）和化合物10（14 mg）。

3 结构鉴定

化合物1～10的结构见图1。

化合物1：浅黄色晶体，分子式为C20H16O5，熔点（mp）：209～211 ℃。电喷雾质谱（ESI-MS）：m/z 337[M+H]+。1H-NMR（CDCl3，400 MHz）δ：12.89（1H，brs，5-OH），7.88（1H，s，H-2），7.36（2H，d，J=8.4 Hz，H-2′ ，H-6′ ），6.86（2H，d，J=8.4 Hz，H-3′ ，H-5′ ），6.69（1H，d，J=10.4 Hz，H-4″ ），6.30（1H，s，H-8），5.60（1H，d，J=10.4 Hz，H-3″ ），1.48（6H，s，2″ -CH3）。13C-NMR（CDCl3，100 MHz）δ：181.21（C-4），159.77（C-7），157.51（C-5），156.98（C-9），156.20（C-4′ ），152.84（C-2），130.47（C-2′ ，C-6′ ），128.38（C-3″ ），123.79（C-3），122.97（C-1′ ），115.86（C-3′ ，C-5′ ），115.60（C-4″ ），106.26（C-10），105.78（C-6），95.07（C-8），78.26（C-2″ ），27.64（C-5″ ，C-6″ ）。與文献[9]对照，其波谱数据基本一致，故确定该化合物为5，4′ -二羟基-8-（3，3-二甲基烯丙基）-2″ ，2″ -二甲基吡喃[5，6 ∶ 6，7]异黄酮{5，4′ -dihydroxy-8-（3，3-dimethylally）-2″ ，2″ -dimethylpyrano[5，6 ∶ 6，7]isoflavone）}。

化合物2：黄色粉末，分子式为C10H12O4，mp：181～182 ℃。ESI-MS：m/z 197[M+H]+。1H-NMR（CDCl3，400 MHz）δ：7.61（1H，d，J=2.0 Hz，H-2′ ），7.57（1H，dd，J=2.0，8.4 Hz，H-6′ ），6.81（1H，d，J=8.4 Hz，H-5′ ），3.98（2H，t，J=6.0 Hz，H-3），3.93（3H，s，3′ -OCH3），3.18（2H，t，J=6.0 Hz，H-2）。13C-NMR（CDCl3，100 MHz）δ：199.70（C-1），153.60（C-3′ ），149.16（C-4′ ），130.53（C-1′ ），124.78（C-6′ ），115.86（C-5′ ），111.89（C-2′ ），58.95（C-3），56.39（3′ -OCH3），41.66（C-2）。与文献[10-11]对照，其波谱数据基本一致，故确定该化合物为3-羟基-1-（4′ -羟基-3′ -甲氧基苯）-1-丙酮[3-hydroxy-1-（4′ -hydroxy-3′ -methoxyphenyl）propan-1-one]。

化合物3：浅黄色粉末，分子式为C29H48O2，mp：202～204 ℃。ESI-MS：m/z 429[M+H]+。1H-NMR（CDCl3，400 MHz）δ：5.68（1H，s，H-6），3.67（1H，m，H-3），1.19（3H，s，H-19），0.91（3H，d，J=6.0 Hz，H-21），0.82（3H，t，J=7.6 Hz，H-29），0.80（3H，d，J=7.6 Hz，H-27），0.79（3H，d，J=7.6 Hz，H-26），0.67（3H，s，H-18）。13C-NMR（CDCl3，100 MHz）δ：202.45（C-7），165.19（C-5），126.29（C-6），70.70（C-3），54.87（C-17），50.13（C-14），50.10（C-9），45.99（C-24），45.58（C-8），43.26（C-13），41.96（C-4），38.86（C-10），38.43（C-12），36.50（C-1），36.24（C-20），34.11（C-22），31.36（C-2），29.30（C-16），28.71（C-25），26.48（C-15），26.47（C-23），23.21（C-28），21.38（C-11），19.95（C-26），19.20（C-27），19.08（C-21），17.46（C-19），11.80（C-18），12.13（C-29）。与文献[12]对照，其波谱数据基本一致，故确定该化合物为3β-羟基豆甾-5-烯-7-酮（3β-hydroxysitost-5-en-7-one）。

化合物4：白色粉末，分子式为C30H50O，mp：172～174 ℃。ESI-MS：m/z 427[M+H]+。1H-NMR（CDCl3，400 MHz）δ：4.69（1H，s，H-29a），4.57（1H，s，H-29b），3.20（1H，dd，J=11.3，4.9 Hz，H-3），1.66（3H，s，H-30），1.03（3H，s，H-26），0.97（3H，s，H-23），0.95（3H，s，H-27），0.83（3H，s，H-25），0.79（3H，s，H-28），0.76（3H，s，H-24）。13C-NMR（CDCl3，100 MHz）δ：151.04（C-20），109.35（C-29），79.04（C-3），55.30（C-5），50.45（C-9），48.31（C-19），48.01（C-18），43.03（C-17），42.85（C-14），40.84（C-8），40.03（C-22），38.89（C-4），38.72（C-1），38.06（C-13），37.19（C-10），35.60（C-16），34.29（C-7），29.86（C-21），28.01（C-23），27.46（C-2），27.43（C-15），25.14（C-12），20.94（C-11），19.33（C-30），18.34（C-6），18.03（C-28），16.15（C-25），15.99（C-24），15.96（C-26），14.57（C-27）。与文献[13]对照，其波谱数据基本一致，故确定该化合物为羽扇豆醇（Lupeol）。

化合物5：白色粉末，分子式为C10H10O3，mp：81～83 ℃。ESI-MS：m/z 179[M+H]+。1H-NMR（CDCl3，400 MHz）δ：9.65（1H，d，J=8.0 Hz，H-9），7.42（1H，d，J=16.0 Hz，H-7），7.14（1H，d，J=2.0 Hz，H-2），7.09（1H，dd，J=2.0，8.0 Hz，H-6），6.96（1H，d，J=8.0 Hz，H-5），6.60（1H，dd，J=8.0，16.0 Hz，H-8），6.00（1H，s，4-OH），3.95（3H，s，3-OCH3）。13C-NMR（CDCl3，100 MHz）δ：193.67（C-9），153.12（C-7），148.95（C-4），146.96（C-3），126.70（C-1），126.47（C-8），124.10（C-6），114.95（C-5），109.47（C-2），56.03（3-OCH3）。与文献[14]对照，其波谱数据基本一致，故确定该化合物为松柏醛（Coniferaldehyde）。

化合物6：浅黄色粉末，分子式为C9H8O3，mp：180～182 ℃。ESI-MS：m/z 165[M+H]+。1H-NMR（Acetone-d6，400 MHz）δ：7.61（1H，d，J=16.0 Hz，H-7），7.55（2H，d，J=8.0 Hz，H-2，H-6），6.90（2H，d，J=8.0 Hz，H-3，H-5），6.33（1H，d，J=16.0 Hz，H-8）。13C-NMR（Acetone-d6，100 MHz）δ：168.12（C-9），160.53（C-4），145.54（C-7），130.90（C-2，C-6），127.10（C-1），116.69（C-3，C-5），115.82（C-8）。與文献[15]对照，其波谱数据基本一致，故确定该化合物为反式对羟基肉桂酸（E-p-hydroxy-coumaric acid）。

化合物7：浅黄色粉末，分子式为C15H10O5，mp：293～295 ℃。ESI-MS：m/z 271[M+H]+。1H-NMR（Acetone-d6，400 MHz）δ：13.03（1H，brs，5-OH），8.15（1H，s，H-2），7.44（2H，d，J=8.5 Hz，H-2′ ，H-6′ ），6.91（2H，d，J=8.5 Hz，H-3′ ，H-5′ ），6.40（1H，d，J=2.1 Hz，H-6），6.29（1H，d，J=2.1 Hz，H-8）。13C-NMR（Acetone-d6，100 MHz）δ：181.62（C-4），165.04（C-7），163.94（C-5），159.03（C-9），158.40（C-4′ ），154.27（C-2），131.16（C-2′ ，C-6′ ），124.01（C-3），123.04（C-1′ ），115.95（C-3′ ，C-5′ ），106.12（C-10），99.84（C-6），94.47（C-8）。与文献[16]对照，其波谱数据基本一致，故确定该化合物为染料木黄酮（Genistein）。

化合物8：白色粉末，分子式为C12H14O5，mp：109～111 ℃。ESI-MS：m/z 239[M+H]+。1H-NMR（CDCl3，400 MHz）δ：7.57（1H，d，J=16.0 Hz，H-7′ ），7.54（2H，d，J=8.0 Hz，H-2′ ，H-6′ ），6.79（2H，d，J=8.0 Hz，H-3′ ，H-5′ ），6.38（1H，d，J=16.0 Hz，H-8′ ），4.15（1H，dd，J=6.4，11.2 Hz，H-1α），4.02（1H，dd，J=6.4，11.2 Hz，H-1β），3.71（1H，m，H-2′ ），3.39（2H，m，H-3）。13C-NMR（CDCl3，100 MHz）δ：166.64（C-9′ ），159.80（C-4′ ），144.65（C-7′ ），130.26（C-2′ ，C-6′ ），125.10（C-1′ ），115.77（C-3′ ，C-5′ ），114.22（C-8′ ），69.42（C-2），65.61（C-1），62.69（C-3）。与文献[17]对照，其波谱数据基本一致，故确定该化合物为1-O-对羟基肉桂酰单甘油酯（1-O-p-coumaroylglycerol）。

化合物9：白色针状晶体，分子式为C10H8O4，mp：199～201 ℃。ESI-MS：m/z 193[M+H]+。1H-NMR（Acetone-d6，400 MHz）δ：7.84（1H，d，J=9.6 Hz，H-4），7.20（1H，s，H-5），6.80（1H，s，H-8），6.19（1H，d，J=9.6 Hz，H-3），3.91（3H，s，6-OCH3）。13C-NMR（Acetone-d6，100 MHz）δ：161.34（C-2），151.81（C-9），151.14（C-7），145.96（C-6），144.70（C-4），113.32（C-3），112.10（C-10），109.95（C-5），103.71（C-8），56.71（6-OCH3）。与文献[18-19]对照，其波谱数据基本一致，故确定该化合物为东莨菪内酯（Scopoletin）。

化合物10：浅黄色粉末，分子式为C15H10O6，mp：273～275 ℃。ESI-MS：m/z 287[M+H]+。1H-NMR（DMSO-d6，400 MHz）δ：12.50（1H，s，5-OH），9.1～10.0（3H，brs，3-OH，7-OH，4′ -OH），8.06（2H，d，J=8.6 Hz，H-2′ ，H-6′ ），6.94（2H，d，J=8.6 Hz，H-3′ ，H-5′ ），6.45（1H，d，J=2.0 Hz，H-8），6.20（1H，d，J=2.0 Hz，H-6）。13C-NMR（DMSO-d6，100 MHz）δ：175.88（C-4），163.97（C-7），160.68（C-9），159.18（C-4′ ），156.15（C-5），146.76（C-2），135.64（C-3），129.49（C-2′ ，C-6′ ），121.64（C-1′ ），115.43（C-3′ ，C-5′ ），102.98（C-10），98.21（C-6），93.47（C-8）。与文献[19]对照，其波谱数据基本一致，故确定该化合物为山柰酚（Kaempferol）。

4 讨论

作为特色苗药，大乌泡的民间应用非常广泛[2]。但目前关于大乌泡化学成分的研究还十分有限，其应用开发领域的基础研究也相对缺乏。本研究对大乌泡茎乙醇提取物的化学成分进行了分析，共分离出了10个化合物，分别鉴定为5，4′ -二羟基-8-（3，3-二甲基烯丙基）-2″ ，2″ -二甲基吡喃[5，6 ∶ 6，7]异黄酮（1）、3-羟基-1-（4′ -羟基-3′ -甲氧基苯）-1-丙酮（2）、3β-羟基豆甾-5-烯-7-酮（3）、羽扇豆醇（4）、松柏醛（5）、反式对羟基肉桂酸（6）、染料木黄酮（7）、1-O-对羟基肉桂酰单甘油酯（8）、东莨菪内酯（9）和山柰酚（10）。其中，化合物1～9均为首次从大乌泡植物中分离得到，化合物2、5、8是首次从悬钩子属植物中分离得到。本研究为进一步阐明苗药大乌泡的藥理活性提供了一定的理论依据，也为其今后的深入开发利用奠定了基础。

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（收稿日期：2017-12-21 修回日期：2018-04-10）

（编辑：张元媛）