HPLC法同时测定消癌平片中通关藤苷A和通关藤苷I的含量

王祁民 马银玲 安静 张磊 孙利民 白万军 温艳虹 董占军

中图分类号 R284.1 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2018）13-1790-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.13.15

摘 要 目的：建立同时测定消癌平片中通关藤苷A和通关藤苷I含量的方法。方法：取消癌平片经三氯甲烷萃取后采用高效液相色谱（HPLC）法进样分析。色谱柱为Symmetry C18，流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液（梯度洗脱），检测波长为223 nm，流速为1.0 mL/min，柱温为25 ℃，进样量为20 μL。采用上述条件测定3批样品中通关藤苷A和通关藤苷I的含量。结果：通关藤苷A、通关藤苷I的质量浓度检测线性范围分别为26.40～264.00 μg/mL（r=0.999 4）、4.59～45.90 μg/mL（r=0.999 3），检测限分别为0.26、0.12 μg/mL，定量限分别为0.79、0.36 μg/mL；精密度、稳定性（12 h）、重复性试验峰面积的RSD均<2.0%（n=6）；加样回收率分别为98.53%～99.28%（RSD为0.20%～0.51%，n=9）、97.00%～98.89%（RSD为0.19%～1.03%，n=9）。3批样品中通关藤苷A和通关藤苷I的含量分别为2.27～2.32、0.64～0.69 mg/g。结论：本试验建立的方法简便，结果准确可靠，适用于消癌平片中通关藤苷A和通关藤苷I含量的同时测定。

关键词 高效液相色谱法； 消癌平片； 通关藤苷A； 通关藤苷I；含量测定

ABSTRACT OBJECTIVE： To develop a method for simultaneous determination of tenacissoside A and tenacissoside I in Xiaoaiping tablets. METHODS： HPLC method was used to analyze Xiaoaiping tablets after extracted by trichlormethane. The determination was performed in Symmetry C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.1% phosphoric acid solution （gradient elution） at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was set at 223 nm， and the column temperature was 25 ℃. The sample size was 20 μL. The content of tenacissoside A and tenacissoside I in 3 batches of samples were determined by above condition. RESULTS： The linear range of tenacissoside A and tenacissoside I were 26.40-264.00 μg/mL （r=0.999 4） and 4.59-45.90 μg/mL （r=0.999 3）， respectively. The limits of detection were 0.26， 0.12 μg/mL， and the limits of quantification were 0.79， 0.36 μg/mL. RSDs of precision， stability （12 h） and repeatability tests were all lower than 2.0%（n=6）. The recoveries were 98.53%-99.28% （RSD=0.20%-0.51%，n=9） and 97.00%-98.89% （RSD=0.19%-1.03%，n=9）. The contents of tenacissoside A and tenacissoside I in 3 batches of samples were 2.27-2.32 mg/g and 0.64-0.69 mg/g， respectively. CONCLUSIONS： The established method is accurate， simple and reliable， which is suitable for simultaneous determination of tenacissoside A and tenacissoside I in Xiaoaiping tablets.

KEYWORDS HPLC； Xiaoaiping tablets； Tenacissoside A； Tenacissoside I； Content determination

消癌平片為通关藤单味药材提取所制，具有抗癌、消炎、平喘的功效，临床主要用于单独或配合放、化疗及手术后的肝癌、食管癌、胃癌、肺癌等恶性肿瘤[1-6]的治疗，其制剂质量标准中仅以绿原酸为测定指标[7]，代表性不足。参考文献[8-9]，笔者采用高效液相色谱（HPLC）法测定消癌平片中抗肿瘤主要活性成分通关藤苷A和通关藤苷I的含量，以便对消癌平片质量进行更全面、准确、简便的控制。通关藤苷A和通关藤苷I结构式见图1。

1 材料

1.1 仪器

2695HPLC仪，包括2487紫外检测器、E2695四元梯度泵、Empower3分析软件、自动进样器（美国Waters公司）；AB204-S分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；KQ3200超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 药品与试剂

消癌平片（长春银诺克药业有限公司，批号：20160601、20160411、20160508，规格：0.3 g/片）；通关藤苷A对照品（山西省中医药研究院，批号：20130513，纯度：>98%）；通关藤苷I对照品（深圳远扬生物技术有限公司，批号：20160311，纯度：>98%）；甲醇和乙腈均为色谱纯，其余试剂为分析纯，水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Symmetry C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脱（0～10 min，32%A；10～10.01 min，32%→42%A；10.01～15 min，42%A；15～15.01 min，42%→50%A；15.01～28 min，50%A）；检测波长：223 nm；流速：1.0 mL/min；柱温：25 ℃；进样量：20 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液 分别精密称取通关藤苷A对照品和通关藤苷I对照品33.02、22.01 mg，分别置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，摇匀，制得对照品溶液Ⅰ（通关藤苷A质量浓度为3.30 mg/mL）及对照品溶液Ⅱ（通关藤苷I质量浓度为2.20 mg/mL）。取对照品溶液Ⅰ8 mL、对照品溶液Ⅱ1.7 mL，置于同一10 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液 取消癌平片，去除糖衣，研细，即得消癌平片粉末。精密称取消癌平片粉末0.55 g，置于60 mL分液漏斗中，加入三氯甲烷6 mL，纯化水24 mL，摇匀，静置。取有机层，连续萃取3次，将所制得溶液蒸干，用甲醇复溶并定容至10 mL量瓶中，0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 空白对照溶液 称取生产厂家处方中所添加各种辅料适量，按“2.2.2”项下方法制备空白对照溶液。

2.3 系统适用性试验

精密量取“2.2”项下混合对照品溶液、供试品溶液、空白对照溶液各适量，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱。结果，在该色谱条件下，各待测成分间、待测成分与杂质峰间均能达到基线分离，分离度>1.5，色谱图见图2。

2.4 线性关系考察

取“2.2.1”项下混合对照品溶液20、40、80、120、160、200 μL，分别置于2 mL量瓶中，加甲醇定容，摇匀，制成系列混合对照品溶液。按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以待测成分质量浓度为横坐标（x）、峰面积为纵坐标（y）进行线性回归，得通关藤苷A和通关藤苷I的回归方程分别为y=9 499.8x+9 251.30（r=0.999 4）、y=13 770x-3 764.40（r=0.999 3）。结果表明，通关藤苷A和通关藤苷I的检测质量浓度线性范围分别为26.40～264.00、4.59～45.90 μg/mL。

2.5 檢测限与定量限考察

取“2.2.1”项下混合对照品溶液倍比稀释，按“2.1”项下色谱条件进样测定。当信噪比为3 ∶ 1时，得检测限；当信噪比为10 ∶ 1时，得定量限。结果表明，通关藤苷A的检测限和定量限分别为0.26、0.79 μg/mL，通关藤苷I的检测限和定量限分别为0.12、0.36 μg/mL。

2.6 精密度试验

取“2.2.1”项下混合对照品溶液适量，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，每次20 μL，记录峰面积。结果显示，通关藤苷A和通关藤苷I峰面积的RSD分别为0.36%、0.52%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.7 稳定性试验

取供试品溶液（批号：20160601）适量，分别于室温下放置0、1、2、4、8、12 h时按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果显示，通关藤苷A和通关藤苷I峰面积的RSD分别为0.26%、0.17%（n=6），表明供试品溶液在室温下放置12 h内稳定性良好。

2.8 重复性试验

取消癌平片（批号：20160601）粉末，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，共6份，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果显示，通关藤苷A和通关藤苷I峰面积的RSD分别为1.05%、1.45%（n=6），表明本方法重复性良好。

2.9 加样回收率试验

取消癌平片（批号：20160601）粉末，共9份，每份约0.30 mg，精密称定，分别置于25 mL分液漏斗中，各加入低、中、高质量的待测成分对照品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率。结果显示，通关藤苷A和通关藤苷I加样回收率分别为98.53%～99.28%（RSD为0.20%～0.51%，n=9）、97.00%～98.89%（RSD为0.19%～1.03%，n=9），表明方法准确度较高。加样回收率试验结果见表1。

2.10 样品含量测定

取3批样品各适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算含量。结果，消癌平片中通关藤苷A和通关藤苷I含量分别为2.27～2.32、0.64～0.69 mg/g，样品含量测定结果见表2。

3 讨论

3.1 检测方法的选择

笔者在前期试验中采用超高效液相色谱-串联质谱法建立了同时测定通关藤药材中3种皂苷通关藤苷A、H、I的含量[10]。由于消癌平片为通关藤经水多次煎煮浓缩而成，其各成分含量理论比药材中高。本试验参考文献[11-12]建立了较为普适的HPLC-紫外检测器法的条件，对消癌平片中2种活性成分通关藤苷A和通关藤苷I进行了含量测定，结果显示，此方法能准确、灵敏地对2种成分进行定性、定量分析。

3.2 质量控制指标的选择

消癌平中含有C21甾体皂苷类、三萜类、多糖类、酚酸类等化学成分[8-9]。绿原酸存在于金银花、杜仲等多种中药植物中，对通关藤及消癌平的研究多集中在绿原酸等酚酸类成分，如谢丽艳、张阿琴等[13-14]报道消癌平注射液中绿原酸、咖啡酸、香草酸等酚酸类成分的含量测定方法。通关藤及消癌平抗肿瘤主要活性成分为C21甾体皂苷（即通关藤苷及其苷元），目前从通关藤中鉴定分离出50多种通关藤苷及其苷元[15]，对其成分功效的研究还处于初步阶段。通关藤苷不仅对人胃癌细胞SGC-7901、小鼠肉瘤细胞S180、小鼠淋巴细胞性白血病细胞P388有显著的体内抑制作用[16]，还可以抑制肝癌细胞增殖，使甲胎蛋白分泌量降低[17]，对对乙酰氨基酚诱导的肝损伤也具有一定的保护作用，其机制可能与其减少自由基产生、提高抗氧化物酶活性有關[18]。2015年版《中国药典》（一部）[1]关于通关藤的含量测定引入了通关藤苷H指标成分，在消癌平注射液质量标准[19]中含量测定引入了通关藤苷A指标成分。本研究在参照国家质量标准[7，19]基础上，结合预试验结果选择了含量较高的通关藤苷A和通关藤苷I[11-12]作为质量控制指标。

3.3 色谱条件的选择

3.3.1 检测波长 通关藤苷A和通关藤苷I属于C21甾体皂苷类化合物，是一类苷元为孕甾烷衍生物与2-脱氧糖等形成的苷，在紫外末端有吸收。文献报道，通关藤苷A和通关藤苷I的最大吸收波长分别为223 nm[1]和230 nm[11]。笔者在选择检测波长时发现，在223 nm波长处通关藤苷A和通关藤苷I峰形均良好。因此，选择223 nm为检测波长。

3.3.2 流动相 笔者在预试验中曾用乙腈和水等度洗脱，通关藤苷A和通关藤苷I色谱峰的分离度小于1.5，而选用乙腈和磷酸溶液梯度洗脱后，30 min内即可完成对样品的分析，通关藤苷A和通关藤苷I均能得到较好的峰形及分离度大于1.5，故本试验最终采用乙腈-0.1%磷酸溶液为流动相并进行梯度洗脱。

综上所述，本研究建立的方法简便，结果准确可靠，适用于消癌平片中通关藤苷A和通关藤苷I含量的同时测定。

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（收稿日期：2018-03-01 修回日期：2018-05-22）

（编辑：余庆华）