UPLC法同时测定野菊花中8种活性成分的含量

范帅帅 田伟 王相 高乐 田宇柔 牛丽颖

摘 要 目的：建立同时测定野菊花中新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、异绿原酸C、木犀草苷、蒙花苷、芹菜素8种活性成分含量的方法。方法：采用超高效液相色谱法。色谱柱为Waters ACQUITY UPLC BEH C18，流动相为0.1%磷酸溶液-乙腈（梯度洗脱），流速为0.3 mL/min，检测波长为335 nm，柱温为35 ℃，进样量为1 μL，样品室温为8 ℃。结果：新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、异绿原酸C、木犀草苷、蒙花苷和芹菜素进样量检测线性范围分别为0.140～1.680、2.211～26.532、0.178～2.136、0.056～0.672、0.460～5.520、1.260～15.120、2.725～32.700、0.120～0.144 ng（r>0.999 6）；检测限分别为0.02、0.02、0.02、0.01、0.01、0.01、0.04、0.01 ng，定量限分别为0.06、0.07、0.07、0.03、0.04、0.04、0.13、0.02 ng；精密度、稳定性（10 h）、重复性试验的RSD均<2%（n=6），平均加样回收率为97.05%～102.04%（RSD为1.03%～1.65%，n=9）。结论：建立的方法分析速度快、灵敏度和分辨率较高、重复性好、结果准确，可用于野菊花中8种活性成分含量的同时测定。

关键词 野菊花；超高效液相色谱法；活性成分；含量测定

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish a method for simultaneous determination of 8 active components in Dendranthema indicum， such as neochlorogenic acid， chlorogenic acid， cryptochlorogenic acid， caffeic acid， isochlorogenic acid C， luteolin， monososide and apigenin. METHODS： UPLC method was adopted. The determination was performed on Waters ACQUITY UPLC BEH C18 column with mobile phase consisted of 0.1% phosphoric acid solution-acetonitrile （gradient elution） at the flow rate of 0.3 mL/min. The detection wavelength was set at 335 nm and column temperature was maintained at 35 ℃. The sample size was 1 μL and sample room temperature was 8 ℃. RESULTS： The linear range of neochlorogenic acid， chlorogenic acid， cryptochlorogenic acid， caffeic acid， isochlorogenic acid C， luteolin， monososide and apigenin were 0.140-1.680， 2.211-26.532， 0.178-2.136， 0.056-0.672， 0.460-5.520， 1.260-15.120， 2.725-32.700， 0.120-0.144 ng （r>0.999 6）， respectively. The limits of detection were 0.02， 0.02， 0.02， 0.01， 0.01， 0.01， 0.04， 0.01 ng， and the limits of quantitation were 0.06， 0.07， 0.07， 0.03， 0.04， 0.04， 0.13， 0.02 ng， respectively. RSDs of precision， stability （10 h） and reproducibility tests were all lower than 2% （n=6）. Average recoveries were 97.05%-102.04%（RSD=1.03%-1.65%， n=9）. CONCLUSIONS： The established method has high analysis speed， high sensitivity， high resolution， good repeatability and accurate results. It can be used for simultaneous determination of 8 active components in D. indicum.

KEYWORDS Dendranthema indicum； UPLC； Active components； Content determination

野菊花是常用的中藥，为菊科植物野菊（Chrysanthemum indicum L .） 的干燥头状花序，具有清热解毒、泻火平肝的功效，常用于疔疮痈肿、目赤肿痛、头痛眩晕等症状[1]。野菊花主治范围广泛，而且两千多年临床应用已证实其清热解毒、泻火平肝之功甚佳，是野菊花栓、野菊花复方降压颗粒以及感冒灵颗粒等清热解毒类中成药和多种凉茶的主要原料药材。野菊花主要含有机酸类、黄酮类、萜类等化合物[2-5]。实验研究发现，其清热解毒的活性成分主要是黄酮和有机酸类化合物[6-7]。黄酮类化合物主要包括蒙花苷、芹菜素、槲皮素、木犀草素等[8]，具有抗炎免疫、保肝、抗肿瘤、保护心血管系统、抗菌等多种药理作用[9-13]；有机酸类化合物主要包括新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、异绿原酸C等，具有较好的抗炎、抗氧化、抗菌等作用[14]。

目前，对野菊花的质量控制主要集中在总黄酮及黄酮类成分的测定[15-16]，而有机酸类成分则只测定了其中绿原酸的含量，2015年版《中国药典》（一部）[1]中野菊花项下是以蒙花苷作为其质量控制指标，指标成分比较单一，不能充分体现野菊花的药效物质基础，不利于野菊花的质量控制。此外，野菊花的入药方式为水煎液，因此水煎液中所含有的活性成分才是其临床有效成分。而转移率作为药材饮片中活性成分在水提工艺中能否实现预期疗效的定量指标，可以反映从药材饮片入药到水煎液中活性成分的溶解、解吸和转移的程度，所以活性成分转移率的高低就会直接影响其临床药效。本试验采用超高效液相色谱（UPLC）法，以野菊花药材以及相应的水煎液为分析对象，系统比较了野菊花药材和水煎液中新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、异绿原酸C、木犀草苷、蒙花苷、芹菜素8种活性成分的含量差异和转移率，通过对比研究，明确野菊花药材和水煎液活性成分之间的量值传递关系，为野菊花质量标准的完善和临床应用提供可借鉴的方法和思路。

1 材料

1.1 仪器

ACQUITY UPLC H-Class系统，包括四元溶剂管理器、自动进样样本管理器、二极管阵列检测器、高温柱温箱、Empower 3色谱工作站（美国Waters公司）；BSA224S-CW电子天平（北京赛多利斯有限公司）；JY10001电子天平（上海精密科学仪器有限公司）；KQ-250超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；BJH-W200F陶瓷自动中药煲（广东天际电器股份有限公司）。

1.2 药品与试剂

新绿原酸对照品（批号：PY20170220，纯度：99.78%）、绿原酸对照品（批号：PY20170216，纯度：99.96%）、隐绿原酸对照品（批号：PY20170224，纯度：99.79%）、异绿原酸C对照品（批号：PY20170303，纯度：91.88%）均购自南京普怡生物科技有限公司；蒙花苷对照品（批号：111528-201509，纯度：97.50%）、咖啡酸对照品（批号：110885-200102，纯度：100.00%）、木犀草苷对照品（批号：11720-201106，纯度：99.30%）、芹菜素对照品（批号：111901-201102，纯度：99.60%）均购自中国食品药品检定研究院；甲醇、乙腈、磷酸为色谱纯，其他试剂均为分析纯，水为超纯水。

1.3 药材

10批野菊花药材均由神威药业集团有限公司提供，经河北省药品检验院的孙宝惠主任中药师鉴定为菊科植物野菊的干燥头状花序，药材信息见表1。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流动相：0.1%磷酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0～3 min，10%→13%B；3～8 min，13%B；8～12 min，13%→15%B；12～15 min，15%→30%B；15～17 min，30%B；17～19.5 min，30%→70%B；19.5～21 min，70%B；21～21.1 min，70%→10%B；21.1～25 min，10%B）；流速：0.3 mL/min；檢测波长：335 nm；柱温：35 ℃；进样量：1 μL；样品室温：8 ℃。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液 分别精密称取新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、异绿原酸C、木犀草苷、蒙花苷、芹菜素对照品1.86、2.01、1.11、2.25、1.40、1.84、5.45、1.35 mg，分别置于2、2、1、2、2、2、50、10 mL量瓶中，加75%甲醇使溶解并定容，摇匀，制成新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、异绿原酸C、木犀草苷、蒙花苷、芹菜素质量浓度分别为0.93、1.01、1.11、1.13、0.70、0.92、0.11、0.14 mg/mL的单一对照品溶液。再分别取上述单一对照品溶液各15、220、16、5、180、50、2 500、9 μL，置于同一10 mL量瓶中，加75%甲醇使溶解并定容，摇匀，即得。

2.2.2 野菊花水煎液 称取野菊花饮片100 g，煎煮2次，一煎加水12倍，浸泡30 min，武火煮沸，文火保持微沸20 min，120目筛网趁热过滤；二煎加水10倍，武火煮沸，文火保持微沸15 min，120目筛网趁热过滤并适当压榨药渣。合并2次煎液，迅速冷却，50 ℃真空减压浓缩定容至500 mL，即得质量浓度为0.2 g/mL的野菊花原药材溶液。

2.2.3 供试品溶液 ①取野菊花原药材溶液1 mL，置于25 mL量瓶中，用75%甲醇稀释至刻度，静置20 min，分出上清液，即得野菊花水煎液供试品溶液。②取野菊花原药材粉末（过三号筛）约0.1 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加入75%甲醇50 mL，密塞，称定质量，超声处理（功率：250 W，频率：40 kHz）30 min，放冷，称质量，加75%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过。取续滤液，即得野菊花药材供试品溶液。

2.3 系统适用性试验

精密量取“2.2”项下混合对照品溶液和供试品溶液适量，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果，在该色谱条件下，待测指标成分新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、异绿原酸C、木犀草苷、蒙花苷、芹菜素色谱峰与相邻峰均都能达到基线分离且分离度良好，峰形对称，理论板数按蒙花苷峰及绿原酸峰计分别不低于12 000、10 000。对照品和供试品色谱图见图1。

2.4 线性关系考察

分别精密吸取“2.2.1”项下混合对照品溶液0.1、0.2、0.5、0.8、1.0、1.2 μL，按“2.1”项下色谱条件测定。以进样量为横坐标（x）、峰面积为纵坐标（y）绘制标准曲线。结果，8个被测化合物在各自标准曲线范围内线性关系良好，见表2。

2.5 检测限与定量限考察

取“2.2.1”项下混合对照品溶液适量，倍比稀释，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，记录各峰面积。当信噪比为3 ∶ 1时，得检测限；当信噪比为10 ∶ 1时，得定量限。结果，新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、异绿原酸C、木犀草苷、蒙花苷、芹菜素的检测限分别为0.02、0.02、0.02、0.01、0.01、0.01、0.04、0.01 ng，定量限分别为0.06、0.07、0.07、0.03、0.04、0.04、0.13、0.02 ng。

2.6 精密度试验

精密吸取“2.2.1”项下混合对照品溶液1 μL，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，计算新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、异绿原酸C、木犀草苷、蒙花苷、芹菜素峰面积的RSD，结果分别为1.41%、1.19%、1.21%、1.55%、1.21%、1.20%、1.13、1.35%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.7 重复性试验

取野菊花水煎液（批号：1609151）适量，6份，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件分析，记录峰面积，计算含量。结果，新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、异绿原酸C、木犀草苷、蒙花苷、芹菜素平均含量的RSD分别为1.63%、1.39%、1.49%、1.05%、1.19%、0.84%、1.21%、1.56%（n=6），表明该方法的重复性良好。

2.8 稳定性试验

精密吸取同一份野菊花水煎液（批号：1609151），按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，分别于制备后0、1、2、3、4、10 h，按“2.1”项下色谱条件进样分析，计算新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、异绿原酸C、木犀草苷、蒙花苷、芹菜素峰面积的RSD，结果分别为1.45%、0.65%、0.82%、1.22%、1.07%、1.60%、0.56%、1.56%（n=6），表明供试品溶液在10 h内稳定性良好。

2.9 加样回收率试验

取已知含量的野菊花水煎液（批号：1609151）9份，每份0.5 mL，分别按样品中目标成分含量的80%、100%、120% 加入各对照品贮备液，每个水平平行测定3份，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定。分别计算新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、异绿原酸C、木犀草苷、蒙花苷、芹菜素的平均回收率，各成分的平均加样回收率依次为101.51、97.05、98.60、101.45、97.84、100.67、99.86、102.04，RSD依次为1.48%、1.65%、1.32%、1.09%、1.22%、1.57%、1.25%、1.03%（n=9），表明本方法的准确度良好。

2.10 含量测定及转移率

取不同批号野菊花药材0.1 g和相应野菊花水煎液1 mL，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件分析，测定各待测成分的含量和转移率，结果见表3、表4、表5。表5中的转移率（%）=W/M×100%，其中W表示煎液中成分的量（mg），M表示饮片中成分的量（mg）。

3 讨论

3.1 分析对象的选择

目前对野菊花的质量研究比较单一，都是对其药材进行含量测定，但实际的应用过程中主要是野菊花水煎液，因此本研究以水煎液与药材为分析对象，通过含量测定和转移率来作对比研究，探究临床应用的煎煮方法对野菊花活性成分的提取效果，发现野菊花中有机酸类成分在水煎液中的转移率较高，黄酮类成分次之，说明从药材到水煎液的过程中，多种活性成分可以被有效提取出来，揭示了传统用药的科学性，为评价野菊花水煎液物质基础提供参考依据。

3.2 指标成分的选择

野菊花中不仅含有以蒙花苷为代表的黄酮类化合物，而且含有以绿原酸为代表的有机酸类成分[17-21]，药材和水煎液中有机酸的总量高于黄酮类，而且研究表明有机酸类活性成分有很强的药理活性，是野菊花中不可或缺的成分，但在含量测定中有机酸类都没有质量控制。野菊花本身含有的活性成分比较多，仅仅测定其中黄酮类成分作为其质量优劣评价的好坏，显然是不适合的，难以完整地反映野菊花化学组分特征，也不符合野菊花的临床疗效。因此本试验采用UPLC法，快速、准确地对野菊花药材和水煎液中新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、异绿原酸C、木犀草苷、蒙花苷、芹菜素8种活性成分进行同时测定，克服了单一成分信息量不全的缺点，可以更加全面可靠地来控制野菊花药材的质量，为野菊花的质量标准和临床用药提供科学的数据和多角度的研究思路。

3.3 色谱条件的选择

大多数对野菊花的分析研究依然是选择传统的HPLC，本法采用UPLC，较普通HPLC方法节约了时间，溶剂的消耗更少；应用PDA全波长扫描的方式，考察了不同波长下的色谱情况，结果在335 nm下得到的色谱图谱峰信息最多，多种化合物可以同时定量测量；同时，利用其较低的样品温度来检测有机酸中不太稳定的活性成分，使对野菊花的质量控制更加精准科学。

3.4 测定结果分析

含量测定结果表明，不同产地的野菊花药材和水煎液中各成分含量差异较大，即使是同一产地的质量也参差不齐。因此，在选择野菊花的时候，应最大限度地控制产地，固定道地产区，这样才能从源头控制其质量。大多数产地中新绿原酸、隐绿原酸和咖啡酸的转移率超过100%，相比冷浸醇提工艺，可能是在水煎煮的过程中，有机酸互相转化或者受熱分解而得到。

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（收稿日期：2018-03-28 修回日期：2018-06-05）

（编辑：余庆华）