HPLC法测定含黄芪中药制剂中毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量

陈莉 王盛 孟楣

摘 要 目的：建立一种测定含黄芪中药制剂中毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量的方法。方法：以我院中药制剂养肝益水颗粒为模型药物，参照2015年版《中国药典》（一部）（简称“药典”）中“黄芪”项下毛蕊异黄酮葡萄糖苷高效液相色谱（HPLC）含量测定方法，采用药典色谱条件并在此基础上，通过增加流动相甲酸比例、延长流动相大极性段洗脱时间等方法进行优化改进，建立含黄芪中药制剂中毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量测定方法，并进行方法学考察。然后用另外2种含黄芪的中药制剂对该法进行初步验证。结果：在药典色谱条件下，模型药物中的毛蕊异黄酮葡萄糖苷色谱峰不能与基线分离；优化后，得到流动相为乙腈-0.2%甲酸溶液（14 ∶ 86，V/V），检测波长为260 nm，柱温为30 ℃，流速为1.0 mL/min的色譜条件。优化条件下毛蕊异黄酮葡萄糖苷质量浓度线性范围为5.08～81.28 μg/mL；精密度、稳定性、重复性试验的RSD均<2.0%（n=6）；平均加样回收率为100.22%（RSD=0.95%，n=6）。经该法测定的5批模型药物中毛蕊异黄酮葡萄糖苷的平均含量为0.014 2%。经验证，该法也可有效分离另外2种含黄芪中药制剂中的毛蕊异黄酮葡萄糖苷。结论：成功建立测定含黄芪中药制剂中毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量的 HPLC法，且该法准确可靠，重现性好，具有一定适用性，可为后续深入研究奠定基础。

关键词 含黄芪中药制剂；毛蕊异黄酮葡萄糖苷；高效液相色谱法；含量测定

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish a method for the content determination of calycosin glycoside in TCM preparation containing Astragalus membranaceus. METHODS： Using TCM preparation Yanggan yishui granules as model drug in our hospital， referring to HPLC method for content determination of calycosin glycoside stated in terms of “A. membranaceus” of 2015 edition of Chinese Pharmacopoeia （part Ⅰ） （called “pharmacopoeia” for short）， use pharmacopoeia chromatogram condition and on this foundation to optimize and improve which by the method of increasing the formic acid proportion of mobile phase and prolonging the gradient elution time of the high polar segment of the mobile phase； the method was established for content determination of calycosin glycoside in TCM preparation containing A. membranaceus. Preliminary verification was carried out by using other two kinds of TCM preparation containing A. membranaceus. RESULTS： Under the chromatographic condition of pharmacopoeia， chromatographic peaks of calycosin glycoside in model drug could not be separated from the baseline. Optimized chromatographic condition included that mobile phase was acetonitrile-0.2% formic acid solution （14 ∶ 86， V/V）； the detection wavelength was 260 nm； the column temperature was set at 30 ℃； the flow rate was 1.0 mL/min. Under optimal conditions， the linear range of calycosin glycoside was 5.08-81.28 μg/mL. RSDs of precision， stability and reproducibility tests were all lower than 2.0% （n=6）. Average recovery was 100.22%（RSD=0.95%，n=6）. Average content of calycosin glycoside in 5 batches of model drugs by this method was 0.014 2%. After validation， the method could effectively isolate calycosin glycoside from other 2 kinds of TCM preparations containing A. membranaceus. CONCLUSIONS： Established HPLC method can be used for content determination of calycosin glycoside in TCM preparations containing A. membranaceus. The method is accurate， reliable， reproducible and suitable， which lays the foundation for further research.

KEYWORDS TCM preparation containing Astragalus membranaceus； Calycosin glycoside； HPLC method； Content determination

毛蕊异黄酮葡萄糖苷为黄芪的主要活性成分，具有免疫调节、抗肿瘤、抗突变、抗损伤、抑制动脉粥样硬化等多方面作用[1-3]。在2015年版《中国药典》（一部）（简称“药典”）中“黄芪”项下收载了毛蕊异黄酮葡萄糖苷和黄芪甲苷的含量测定方法，黄芪甲苷常使用蒸发光散射器进行检测，但检测基线波动较大，影响试验结果的准确性。毛蕊异黄酮葡萄糖苷有共轭基团，紫外有吸收，常使用紫外检测器检测，其最大吸收波长为260 nm，灵敏度高。因此，常将毛蕊异黄酮葡萄糖苷作为黄芪含量测定的指标。

有相关研究也报道了毛蕊异黄酮苷的含量测定方法[3-10]，但是大多都是参考药典中“黄芪”项下毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量测定的梯度洗脱法。由于毛蕊异黄酮葡萄糖苷出峰时间太早（约6 min），分离效果差，虽然调整了药典中的流动相，推迟了毛蕊异黄酮葡萄糖苷的出峰时间[2-10]，可有效分离毛蕊异黄酮葡萄糖苷和杂质成分，但是笔者利用药典中的方法测定成分复杂的含黄芪中药制剂中的毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量时，其分离效果欠佳。

因此，笔者选择我院制备的以黄芪为君药的中药制剂——养肝益水颗粒为模型药物，药典中“黄芪”项下毛蕊异黄酮葡萄糖苷的色谱条件为基础，通过增加甲酸比例、延长流动相高极性段洗脱时间等方法优化色谱条件，建立含黄芪中药制剂中毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量测定方法，并用另外2种含黄芪的中药制剂对该法进行初步验证，为后续的深入研究奠定基础。

1 材料

1.1 儀器

1260高效液相色谱仪、DAD紫外检测器均购自美国安捷伦科技公司；JA5003N电子天平（上海菁海仪器有限公司）。

1.2 药品与试剂

养肝益水颗粒（批号：20151110、20151214、20160608、20160711、20160801、20160905，规格：10 g/袋）、芪藤消浊颗粒（批号：20160804，规格：10 g/袋）、复方芪薏胶囊（批号：20160808，规格：0.4 g/粒）均由我院制剂中心生产；毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号：111920-201105，纯度：>97.1%）；甲醇、乙腈均为色谱纯，水为蒸馏水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 供试品溶液的制备 取养肝益水颗粒（批号：20160711）适量，于研钵中研细，精密称取2 g药粉，加入圆底烧瓶中；再加入50 mL甲醇并称质量，于水浴锅上加热回流4 h；于室温下放冷，再称质量，并用甲醇补足减失的质量，摇匀后滤过，取续滤液25 mL，置于蒸发皿中蒸干，残渣加甲醇定容至10 mL量瓶中，摇匀，即得。

2.1.2 对照品溶液的制备 精密称定毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品6.35 mg，加甲醇定容至50 mL量瓶中，摇匀，即得。

2.2 优化毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量测定色谱条件

2.2.1 药典色谱条件 参考药典“黄芪”项下毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量测定的色谱条件[2]。色谱柱为Zorbax Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；检测波长为260 nm；柱温为30 ℃；进样量为10 μL；流速为1.0 mL/min；乙腈为流动相A，0.2%甲酸溶液为流动相B，梯度洗脱（0～20 min，20%→40%A；20～30 min，40%A）；对供试品溶液及对照品溶液进行分析。结果，供试品溶液中的毛蕊异黄酮葡萄糖苷与基线不能分离，需进一步试验。色谱图详见图1。

2.2.2 药典色谱条件优化 （1）加大流动相极性。在“2.2.1”项试验结果的基础上，增加流动相中甲酸比例以增大流动相极性。同“2.2.1”项下色谱条件以梯度1（0～20 min，15%→40%A；20～30 min，40%A）或梯度2（0～20 min，10%→40%A；20～30 min，40%A）分别进行洗脱。结果，两种梯度洗脱方法仍不能使毛蕊异黄酮葡萄糖苷与基线分离，但随着流动相极性的增大，出峰时间有所推迟，从原来的6 min左右推迟到12 min左右，其分离效果相对“2.2.1”项试验结果有所改善，但仍需进一步试验。两种梯度洗脱后供试品溶液的色谱图见图2（对照品溶液色谱图略）。（2）延长流动相大极性段洗脱时间。在加大流动相极性的基础上，延长流动相中较大极性阶段的洗脱时间。①洗脱时间延长5 min，洗脱梯度为（0～5 min，15%A；5～30 min，15%→40%A；30～40 min，40%A）；②洗脱时间延长10 min，洗脱梯度为（0～10 min，15%A；10～30 min，15%→40%A；30～40 min，40%A）；③洗脱时间延长20 min，洗脱梯度为（0～20 min，15%A；20～30 min，15%→40%A；30～40 min，40%A）。以上述3种梯度洗脱条件，分别进行试验。结果，供试品溶液色谱图详见图3（对照品溶液色谱图略）。

由图3A、B可知，流动相中大极性阶段的等度洗脱时间越短，基线坡度越大，使得毛蕊异黄酮葡萄糖苷与基线不分离，且其左右干扰峰仍明显存在。将流动相大极性段等度洗脱时间延长至20 min时，毛蕊异黄酮葡萄糖苷在15 min左右出峰，且左边仅1个干扰峰（见图3C）；说明流动相以15%A等度洗脱时对毛蕊异黄酮葡萄糖苷分离效果更佳。

2.2.3 流动相等度洗脱试验 在“2.2.2”项试验结果的基础上，为了去除毛蕊异黄酮葡萄糖苷左边干扰峰，试验在“2.2.1”项下色谱条件下，调整流动相比例至乙腈-0.2%甲酸溶液（14 ∶ 86，V/V），进行试验。结果，毛蕊异黄酮葡萄糖苷与杂质峰能够有效分离，色谱图详见图4。因此，确定该条件为毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量测定的优选色谱条件。

2.3 系统适用性试验

精密吸取对照品溶液10 μL，以“2.2.3”项优化的色谱条件进样测定。对照品溶液色谱图详见图5。

结合图4结果，以毛蕊异黄酮葡萄糖苷峰计理论板数>3 000，相邻峰间分离度>1.5，拖尾因子T=0.98（0.952.4 方法学考察

2.4.1 标准曲线的绘制与线性范围的考察 取“2.1.2”项下对照品溶液适量，用甲醇定量稀释成毛蕊异黄酮葡萄糖苷质量浓度分别为5.08、10.16、20.32、40.64、81.28 μg/mL的溶液。分别精密吸取各质量浓度溶液10 μL，注入色谱仪，按“2.2.3”项下色谱条件进行测定，以毛蕊异黄酮葡萄糖苷的质量浓度为横坐标（x）、以峰面积为纵坐标（y）作标准曲线，得到回归曲线方程为：y=29.049 6x-10.814 7（r=0.999 5），表明毛蕊异黄酮葡萄糖苷检测质量浓度在5.08～81.28 μg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.4.2 精密度试验 精密吸取“2.1.2”项下对照品溶液10 μL，按“2.2.3”项下色谱条件连续进样6次，记录色谱图，测定峰面积。结果，毛蕊异黄酮葡萄糖苷峰面积的RSD=1.24%（n=6），表明该方法精密度良好。

2.4.3 稳定性试验 取“2.1.1”项下供试品溶液，于室温放置0、2、4、6、8、10 h后按“2.2.3”项下色谱条件进样分析。结果，毛蕊异黄酮葡萄糖苷峰面积的RSD=1.94%（n=6），表明供试品溶液在10 h内稳定性良好。

2.4.4 重复性试验 取“2.1.1”项下供试品溶液6份，按“2.2.3”项下色谱条件进样分析，记录色谱图，测定峰面积，并计算毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量。结果，毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量的RSD=1.42%（n=6），表明该方法重复性良好。

2.4.5 方法回收率试验 精密称取约1 g养肝益水颗粒（批号：20160711）6份，分别加入“2.1.2”项下对照品溶液1.4 mL，按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.3”项下色谱条件进样测定，计算加样回收率。结果，毛蕊异黄酮葡萄糖苷的平均加样回收率为100.22%（RSD=0.95%，n=6），结果详见表1。

2.5 样品含量测定

取6批养肝益水颗粒样品，分别按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液各3份，依次进样测定，计算毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量。结果，6批样品的平均含量为0.014 2%，样品含量测定结果详见表2。

2.6 验证试验

将我院另外2种含黄芪的中药制剂，利用建立的HPLC法测定毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量，进行方法验证。精密称取芪藤消浊颗粒2 g、复方芪薏胶囊1.2 g，分别按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，以“2.2.3”项优化的色谱条件进样分析，记录色谱图。结果，2种含黄芪的中药制剂的毛蕊异黄酮葡萄糖苷峰附近无杂质干扰，且基线分离良好；以毛蕊异黄酮葡萄糖苷峰计理论板数均>3 000，相邻峰间分离度均>1.5，拖尾因子T=1.02（0.95