胶体金免疫层析法快速定量检测糙米中重金属离子铅

刘美辰　路宏博　赵小旭等

[摘要]本研究建立了快速定量检测糙米中重金属离子铅的胶体金免疫层析试纸条分析方法。通过一系列的实验研究了该方法的灵敏度、重复性和特异性。结果表明用免疫胶体金法测定糙米中铅的检出限为0.041mg/kg，定量限为0.097mg/kg，方法重现性较好，使用胶体金免疫层析法和原子吸收光谱法同时检测加标样品，结果一致。因此，该方法适用于糙米中重金属离子铅的快速定量检测。

[关键词]铅；胶体金免疫层析法；乳制品

中图分类号：S511 文献标识码：A DOI：10.16465/j.gste.cn431252ts.20180213

在自然情况下，土壤中重金属含量较低，一般情况下不会对人体及生态环境造成很大的危害。但是，随着我国工业的发展，固体废弃物不断增加，河流污染严重，同时农业化肥和农药的大量使用也加剧了重金属在土壤中的大量累积。目前我国耕地重金属污染严重，被污染的耕地面积也在不断增加。铅是受污染粮食中的有毒重金属之一，对人的神经系统、骨髓造血机能、消化系统、生殖系统等都有明显毒害作用且具有积累性，重金属铅能与人体中多种酶结合进而干扰人体多方面的生理活动。当人体中铅含量升高时，会破坏血红蛋白的合成，造成贫血、血压增高、肾损伤，造成孕妇流产和堕胎，破坏神经中枢，影响脑发育、影响生育能力，造成小孩发育迟缓和行为冲动。粮食作为人们饮食的主要食物来源，其安全性对于国民的健康至关重要。

目前常见的重金属离子铅的检测方法主要是石墨炉原子吸收光谱法、原子荧光光谱法、电感耦合等离子体质谱法等，这些方法需要费用高昂的大型仪器设备、专门的实验室、专业的操作技术人员和复杂的样品前处理过程，不适合现场快速筛选检测。

目前检测重金属铅的方法多为仪器法，利用胶体金免疫层析法检测重金属离子铅较少，因此本文基于胶体金免疫层析技术，检测主要的粮食类别之一：糙米中重金属铅的含量具有必要性，并且对于粮库等机构来说具有实际意义。

1材料与方法

1.1主要仪器

干式加热器（HMG-GS北京华安麦科生物技术有限公司）、胶体金读数仪（BMZ 6000北京美正生物科技有限公司）、200μL移液器（赛多利斯（上海）贸易有限公司）、计时器（北京华安麦科生物技术有限公司）、离心管（50mL，20mL，洁特）、枪头（BIOFIL）、一次性手套（麦迪康）、离心机（DM0412大龙兴创实验仪器（北京）有限公司）、原子吸收光谱仪（PinAAcle 900T perkinelmer公司）、涡旋混合器（TZL-5013苏州珀西瓦尔实验设备有限公司）、分析天平（PL-602E梅特勒一托利多分析天平），20目筛网。

1.2主要试剂

超纯水、硝酸、硫酸、EDTA、乙酸乙酯、甲醇、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钠等。

1.3方法

1.3.1检测原理

重金属铅检测试纸条应用了竞争抑制胶体金免疫层析的原理（结构如图1所示）。将金标抗体结合在金标垫/微孔中，将抗原（T线）和二抗（C线）固定于NC膜上，当待测样品加到样品垫/微孔中后，样本中抗原与金标抗体结合，通过层析作用向前移动。当移至（T线）区域时，偶联抗原和未结合金标抗体结合而被截留，聚集在检测线（T线）上，剩余金标抗体越过检测线（T线），在质控线（C线）处与二抗结合显色。配合仪器读取结果如图1所示。

1.3.2检测方法

1.3.2.1样品前处理

称取2.0g±0.02g均质（过20目筛网）样本于50mL离心管中，加入6mL硝酸溶液（0.5M）和4mL乙酸乙酯，具塞，充分振荡5min后，4 000rpm离心5min；取1mL上清，加入2mL硫酸溶液（1M），振荡3min，4 000rpm离心3min；弃上清，取500μL下清，立即加入0.5M PBS溶液（5min内），振荡混匀；取250μL该混合液，加入200μL EDTA-水溶液（0.5M），振荡均匀，1min内待检。

1.3.2.2检测步骤

（1）在进行检测前先完整阅读使用说明书，从原包装中取出试剂桶，打开后取出所需数量的微孔试剂和试纸条，并做好标记；微孔试剂取出后，请立即盖好试剂桶盖。

（2）使用前将试纸条、微孔试剂和待检样品恢复至室温25℃；将所需微孔试剂置于加热器上的微孔中。一次检测样品数量不要超过4个；如果一次检测样品数量超过4个，请按照4个一组，分批检测。

（3）用微量移液器移取200μL回温后的样品于微孔试中，缓慢抽吸至检测样品与微孔试剂充分混匀；使用计时器，开始计时。

（4）40℃条件下孵育5min；孵育结束后，停止计时；从试剂桶中取出所需数量的试纸条并插入微孔试剂中，使印有LOGO手柄端向上，另一端向下并充分浸入溶液中；再次按下计时器，开始第二次5min孵育。

（5）第二次5min孵育结束后，停止计时；取出试纸条，擦除下端样品垫，立即使用读数仪读取检测结果。注意不要接触或损坏测试条中部检测区域，并在1min内读取结果。

（6）检验完毕，剩余试纸条和微孔试剂放回试剂桶并盖紧桶盖，剩余所有的试剂盖紧瓶盖，一起放回试剂盒中，2～8℃保存。

1.3.2.3标准曲线的建立

称取陰性样品，每份2g，然后加入重金属铅标准品，添加铅含量在0μg/kg，20μg/kg，50μg/kg，100μg/kg，200μg/kg，400μg/kg。每个浓度三份平行。然后其余步骤同1.3.2.2，以T线灰度值作为纵坐标，以对应的样品中铅添加浓度值为横坐标，建立标准曲线。

1.3.2.4方法检出限及定量限

称取20份阴性样本，每份2g，根据步骤1.3.2.1和1.3.2.2进行检测，该方法检出限LOD以阴性样品20次测定结果的均值加3倍标准偏差计算，定量限LOQ以空白样品20次测定结果的均值加10倍标准偏差计算。

1.3.2.5准确性

利用胶体金分析法与国家标准方法分别对8个糙米样品进行双试验检测，采用配对t检验法比较两种方法的检测结果是否存在显著性差异。

1.3.2.6重复性

选取中等水平糙米样品，重复测定8次，按照GB/T 4889-2008《数据的统计处理和解释正态分布均值和方差的估计与检验》中7.1单总体方差或标准差检验实施x2分布检验，判断该方法重复性测定标准差是否超过标准方法中规定的重复性要求，同时采用8次测定极差与现有国家标准规定的8次测定重复性临界极差进行对照，考察该方法的重复性。

2结果分析

2.1结果判定

（1）打开样品卡壳，将定量试纸条插入样品卡壳槽内，保证白色NC膜表面的两条色带在卡壳视窗中间。

（2）将样品卡壳插入读数仪样品卡槽中，按照仪器操作程序，点击触屏“检测”键或“TEST”按钮，读取结果。

2.2标准曲线的建立

将糙米的前处理液按照1.3.2.2用胶体金试纸条进行检测并用胶体金读数仪扫描，以扫描检测线的灰度值为纵坐标，以添加后的铅浓度值（mg/kg）为横坐标，建立标准曲线，结果如图2所示。

2.3方法的检出限和定量限

通过对20个独立的阴性样品进行测定，该方法的检出限LOD结果为0.041mg/kg，定量限LOQ结果为0.097mg/kg，具体的检测结果如表1所示。

2.4准确性实验

分别采用胶体金试纸法和仪器法对8个已知浓度的样品进行检测，检测结果如表2所示。根据检测结果可知，胶体金试纸法和仪器法的检测结果不存在显著性差异。

2.5重复性实验

按照步骤1.3.2.1和1.3.2.2进行检测，检测结果如表3所示，通过检测结果计算得出，检测结果平均值为0.125mg/kg，标准偏差s=0.013mg/kg，极差=0.043mg/kg；根据GB 5009.12-2017规定：在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算数平均值的20%，则两次测定绝对差（即重复性限r）≤0.025，8次测定的重复性临界极差ERR95（8）=F（8）*r/2.8=0.038，标准规定的重复性标准差Sr=r/2.8=0.008 9。显著性水平a=0.05情况下，查表得x20.95（7）=14.067，x2=（n-1）s2/sr2=15.86>x20.95（7），极差0.043>重复性临界极差ERR95（8），檢测结果表明该方法测定的重复性标准差和极差均超过标准方法中规定的重复性要求。

2.6注意事项

（1）检测试纸条请在有效期内使用，使用前将试纸条和待检样本恢复至室温。

（2）样本大米和糙米可共用一条曲线，即糙米样本也可用大米的曲线进行检测。

（3）所有溶液使用前需摇匀，试剂C会有沉淀出现，但不影响结果。

（4）试剂A具有微弱的挥发性，建议佩戴口罩或在通风橱中操作。

（5）样本在振荡完，移取1.8mL上清时，偶尔会有颗粒物堵塞枪头的情况发生，可吹出、重新吸取。

（6）偶有样本因颗粒度过细等出现乳化现象，造成上清取液量不足，则“方法二”中第一步振荡5min后，可以静置10min后再离心，也可适当增加离心时间至8～10min。

（7）检测过程中请勿触摸试纸条中央的白色膜面，如不小心接触后请遗弃。

（8）枪头与离心管等耗材不可混用，以免交叉污染。

（9）样品要与微孔中试剂充分混合均匀，避免产生泡沫。

（10）第二次孵育后，务必立即去掉测试条下端的样品垫，并在1min内读取结果，因为试纸条干燥后颜色深度会产生一定变化，影响最后的结果。

（11）仪器读取结果必须使用配套读数仪和样品卡槽。

（12）试剂从试剂桶取出后，请立即盖好试剂桶盖。用完一桶试剂再打开另外一桶，如果一次用不完8个微孔，可取用所需数量的微孔，将剩余微孔立即放回到装有干燥剂的试剂桶中密封保存。请小心开启微孔盖，以保证全部试剂保留在微孔中。

（13）如发现阳性，检测结果需要使用法定的确证方法进行确证。

（14）试验遇到的任何问题，请与供应商联系。

3结论

通过一系列性能评价实验，重金属离子铅胶体金免疫层析试纸条检测时间在15min内，检出限为0.041mg/kg，定量限为0.097mg/kg。该方法重复性良好，检测结果与仪器法检测结果一致，方法简便，对人员专业技能要求较低，并且其灵敏度、稳定性和特异性等均达到了食品中有毒有害物质快速检测的要求，非常适用于粮库收购环节的筛选工作。