内部沸腾法优化螺旋藻多糖提取工艺研究

刘玉环 贺亚银 张喜峰 张丽妹

摘 要：采用内部沸腾法优化螺旋藻多糖提取工艺.利用正交实验设计分析乙醇浓度、料液比、提取温度和时间对螺旋藻多糖得率的影响.结果表明：用内部沸腾法提取螺旋藻多糖的最佳条件为：40%乙醇，料液比1∶14，温度80 ℃，提取时间5 min，多糖得率是8.92%.内部沸腾法快速、高效、经济，可有效用于螺旋藻多糖的提取.

关键词：螺旋藻；内部沸腾法；多糖

[中图分类号]TQ110 [文献标志码]A

文章编号：1003-6180（2018）02-0051-05

Abstract：Polysaccharides from Spirulina Platensis were extracted by inner ebullition method. The effects of parmeters ranged？from concentration of ethanol， solid-liquid ratio， extraction temperature， and time on the yield of Polysaccharides were investigated by orthogonal experiment. Experiment results show that the optimum extraction conditions are as followed： the volume fraction of ethanol solution saturated the materials is 40%， the ratio of material to solution was 1：14（g/mL）， the extraction temperature was 80℃， extraction time was 5min. The extraction rate of polysaccharides reached 8.92% under the optimum extraction. The method of inner ebullition is a rapid， efficient， economic method to extract the polysaccharide fromSpirulina Platensis.

Key words：Spirulina Platensis； inner ebullition method； polysaccharides

螺旋藻是一種人类可安全食用的蓝绿藻，其多糖在食品生产中扮演稳定剂、增稠剂和乳化剂的角色.[1]螺旋藻多糖可降低丙型肝炎病毒（基因型4）的复制[2]，降低肺转移的B16-BL6细胞对基膜的侵袭[3].Chaiklahan [4]研究表明，螺旋藻多糖具有较强的抗氧化性，对DPPH自由基清除率可达31%.因此，螺旋藻多糖在医疗领域的应用具有广阔的前景.

螺旋藻多糖的提取方法普遍采用热水浸提法[5].宋照风[6]采用超声和冷碱结合法对螺旋藻干粉中可溶性多糖进行提取，该法提取的多糖杂质较多，碱性环境可导致多糖水解.王以斌[7]等采取酶解辅助超声对螺旋藻多糖进行提取，优化了工艺条件，但所需酶的成本较高.内部沸腾法是一种快速强化植物有效活性成分的提取方法[8]，具有操作简便、杂质较少、回收率较高等优点.有关内部沸腾法提取螺旋藻多糖的研究尚未见报道.本文以螺旋藻干粉为材料，采用内部沸腾法提取螺旋藻多糖，研究乙醇浓度、料液比、提取温度、提取时间对螺旋藻多糖提取效果的影响，旨在为螺旋藻多糖的提取提供简便、快速的方法，同时为其多糖进一步分离纯化提供技术支撑.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

极大螺旋藻粉末（由甘肃凯源微藻中心提供）；无水乙醇、浓硫酸、苯酚、葡萄糖均为分析纯.

1.2 仪器与设备

722型可见分光光度计（上海光谱仪器有限公司）；DKB-501超级恒温水浴锅（扬州市三发电子有限公司）；DD-5M立式大容器离心机（湖南凯达科学仪器有限公司）；PL203电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）.

1.3 试验方法

1.3.1 标准曲线的制作

准确称取100 mg葡萄糖，蒸馏水定容至1 000 mL，混匀后，分别吸取0.2，0.4、0.6，0.8，1.0 mL于试管中，加水补足至2 mL，各加入6%苯酚1mL，浓硫酸5 mL.混匀后静置，待冷却后在490 nm处测定吸光值，以葡萄糖含量X（μg）为横坐标，以吸光值Y为纵坐标绘制标准曲线，计算得回归方程为：Y=0.0073X+0.0366，R2=0.9728.

1.3.2 内部沸腾法提取螺旋藻多糖

称取0.5 g螺旋藻粉末，加入一定量一定浓度的乙醇均匀润湿20 min，使其充分进入物料内部后，按照一定比例加入一定温度热水.提取一段时间后，2000 r/min离心5 min，测上清液中多糖含量，计算多糖得率.

（1）乙醇浓度对螺旋藻多糖提取效果的影响

称取5份螺旋藻粉末各1 g，分别加入不同浓度的乙醇（10%，20%，30%，40%，50%）5 mL，充分润湿20 min后，按照料液比1∶14（g/mL）比例加入80 ℃热水.在恒温水浴锅中解析3 min后，2000 r/min离心5 min，测上清液中多糖含量，计算多糖得率.

（2）料液比对螺旋藻多糖提取效果的影响

称取5份螺旋藻粉末各1 g，加入20%乙醇各5 mL，充分润湿20 min后，按照不同料液比（1∶10，1∶12，1∶14，1∶16，1∶18（g/mL）加入80 ℃热水.在恒温水浴锅中解析3 min后，2000 r/min离心5 min，测上清液中多糖含量，计算多糖得率.

（3）提取温度对螺旋藻多糖提取效果的影响

称取5份螺旋藻粉末各1 g，加入20%乙醇各5 mL，充分润湿20 min后，按照料液比1∶14比例加入不同溫度（60，70，80，90，100 ℃）的热水.在恒温水浴锅中解析3 min后，2000 r/min离心5 min，测上清液中多糖含量，计算多糖得率.

（4）提取时间对螺旋藻多糖提取效果的影响

称取5份螺旋藻粉末各1 g，加入20%乙醇各5 mL，充分润湿20 min后，按照料液比1∶14比例加入80 ℃的热水.在不同时间（1，3，5，7，9 min）解析，2000 r/min离心5 min，测上清液中多糖含量，计算多糖得率.

1.3.3 正交试验设计

在单因素基础上，根据结果对其条件进行正交设计优化，获得最佳的提取条件.

1.3.4 多糖得率计算

将制备的多糖样品溶液按照1.3.1方法进行测定，计算公式如下：

R=X×V2×NV1×M.

式中，R为螺旋藻多糖得率%，X为为螺旋藻多糖的含量（μg），M为螺旋藻质量（g），V1为加入反应体系中多糖提取液体积（mL），V2为制备的多糖提取液体积（mL），N为稀释倍数.

1.3.5 内部沸腾法与其他提取方法的比较

将内部沸腾法在最优条件下提取的多糖得率与超声波辅助、传统热水浸提、微波辅助方法相比较.

2 结果与分析

2.1 内部沸腾法提取螺旋藻多糖的单因素试验

2.1.1 乙醇浓度对螺旋藻多糖得率的影响

由图1可知，随着乙醇浓度的增加，螺旋藻多糖得率逐渐增大，在乙醇浓度为40%时达到最大值，之后呈下降趋势.原因可能是低浓度的乙醇使物料内部沸腾强度弱，多糖得率较低；而多糖在高浓度乙醇中溶解性较差.因此，螺旋藻多糖得率的最佳乙醇浓度为40%左右.

2.1.2 料液比对螺旋藻多糖得率的影响

由图2可知，随着料液比的增加，多糖得率也随之增加，当料液比大于1∶14（g/mL），得率反而开始下降.料液比太高或太低均会影响多糖得率.料液比较低时，细胞内外多糖浓度差异较低[9]，提取不充分，不利于细胞中多糖的溶出，从而降低多糖的得率.料液比太高，导致提取液中多糖浓度较低，且后续处理过程工作量较大，增加工作时间和成本.因此，1∶14（g/mL）为螺旋藻多糖得率最佳的料液比.

2.1.3 提取温度对多糖得率的影响

由图3可知，随着温度的升高，螺旋藻多糖得率呈现先上升后下降的趋势，原因可能是提取温度较低时，多糖在提取过程中内部扩散较慢，溶解不充分，提取效果较差.随着温度升高，内部乙醇沸腾剧烈，当其速度达到一定程度时，乙醇挥发较快，导致螺旋藻多糖提取不完全.因此，螺旋藻多糖提取温度选择80 ℃.

2.1.4 提取时间对螺旋藻多糖得率的影响

由图4可知，随着提取时间的延长，螺旋藻多糖的内部沸腾提取速度很快，当提取时间为3 min时，螺旋藻多糖的得率最大，提取时间延长，非糖类物质溶出，使多糖得率下降.所以，螺旋藻多糖得率最佳解析时间为3 min.

2.2 内部沸腾法提取多糖的正交试验

试验以乙醇浓度%（A）、料液比（g/mL）（B）温度℃（C）、解析时间min（D）作为正交试验的5个因素，以多糖得率为分析指标，进行16组正交试验L9（34）.见表1和表2.

由表2和表3可知，各因素对螺旋藻多糖得率的影响依次为：A（乙醇浓度）>D（时间）> C（温度）>B（料液比）.影响螺旋藻多糖提取的因素P值均大于0.05，该取值范围差异不显著.方差分析中F值结果与表2中极差分析结果吻合，即A（乙醇浓度）相比其他因素来说，对多糖提取效果的影响较大，说明按照乙醇浓度参数对物料进行内部渗透，使多糖最大量的溶出，提高得率.最佳提取工艺条件为：A2B2C2D3，即乙醇浓度40%，料液比1∶14（g/mL），提取温度80 ℃，提取时间5 min.在此最佳条件下，进行验证性实验，测得螺旋藻多糖平均得率8.92%，说明正交试验设计获得的工艺条件是合理的.

2.3 内部沸腾法与其他提取方法的比较

内部沸腾法与超声波法、热水浸提、微波法相比，螺旋藻多糖提取效果差异显著（P<0.05）.内部沸腾和微波法提取多糖所需时间较短，热水提取时间最长.微波和超声波均需专门设备才可进行，内部沸腾法无需特殊设备，操作简便.因此，内部沸腾方法省时、简单、成本较低.

3 结论

本试验采用内部沸腾法对螺旋藻多糖进行提取，采用单因素和正交试验优化获得了多糖提取的最佳条件：乙醇浓度40%，料液比1∶14（g/mL），提取温度80 ℃，提取时间5 min，该条件下多糖得率8.92%.内部沸腾法与其他提取方法相比，具有操作简单、低耗能、回收率较高等优点，说明此法为提取螺旋藻多糖提供了一种高效、快速的提取方法，为多糖进一步分离纯化奠定基础，对螺旋藻多糖在食品和医药领域的深加工，具有一定的现实意义.

参考文献

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[3] Mishima T， Murata J， Toyoshima M， et al. Inhibition of tumor invasion and metastasis by calciumspirulan （Ca-SP）， a novel sulfated polysaccharide derived from a blue-green alga， Spirulina platensis[J]. Clinical & experimental metastasis， 1998，16（6）：541-550.

[4] Chaiklahan R， Chirasuwan N， Triratana P， et al. Polysaccharide extraction from Spirulina sp. and its antioxidant capacity[J]. International journal of biological macromolecules，2013，58：73-78.

[5] 王群，陈诗科，李浩尧，等.螺旋藻多糖提取纯化及其抗结肠腺癌活性评价简[J].食品与机械，2016（6）：151-155.

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[7] 王以斌，梁强，何碧娟，等.螺旋藻多糖酶解辅助超声波提取工艺的优化[J].現代農業科技，2009，2009（8）：234-235.

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[9] 倪福太，庄妍.植物多糖研究进展[J].牡丹江师范学院学报： 自然科学版，2010（4）：34-36.

[10] 张喜峰，杨光，郑雪.发菜多糖絮凝纯化及体外清除自由基分析[J].牡丹江师范学院学报：自然科学版，2018（1）：60-64.

编辑：琳莉