菌草灰树花蛋白质提取工艺优化研究

陈少美 薛小兰

摘要：利用正交法筛选菌草灰树花蛋白质最优提取工艺，结果表明：提取因素对指标影响依次为C（细胞超声破碎次数）>D（浸提pH值）>B（浸提温度）>A（料液比）；最优提取工艺为料液比1∶50、浸提温度45℃、浸提pH值10、细胞超声粉碎5次，提取率达到095%。

关键词：灰树花；蛋白质提取；工艺优化

DOI： 1013651/jcnkifjnykj201802011

Optimization of Protein Extraction Technology for Grifola Frondosa

CHEN Shaomei， XUE Xiaolan

（Fujian Vocational College of Bioengineering， Fuzhou， Fujian 350007）

Abstract： An orthogonal experimental design was used to optimize the protein extraction technology for Grifola frondosa. The results showed that the influence of extraction factors on the index was decreased in order C>D>B>A. The optimal extraction technology included， the ratio of material to liquid was 1∶50， the extracting temperature was 45℃， the pH value was 10， and 5 times of the cells ultrasonic crush， and under these conditions， the extraction rate for protein of Grifola frondosa reached 095%.

Key words： Grifola frondosa； protein extraction； technology optimization

灰树花俗称“栗子蘑”，又名贝叶多孔菌、莲花菌等，隶属于担子菌纲、多孔菌目。灰树花是一种十分珍贵的药用真菌[1]，化学成分主要包括多糖、蛋白质、核酸、多酚等，除多糖外，灰树花中含量较高的另一功能性成分是蛋白质， Nanba h等[2]最早发现了灰树花中的抗肿瘤多糖，其组分中含有1%～20%的蛋白可能具有独特作用。另研究表明，从灰树花中提取的小分子蛋白具有抗單纯孢疹病毒I型的作用[3]。Tsao y w等[4]研究发现灰树花蛋白具有刺激小鼠树突状细胞和增强小鼠抗肿瘤免疫的功能。

国内对灰树花菌丝体蛋白的提取工艺鲜有报道。真菌蛋白的提取一般采用碱提法或水浸提法，但耗时长而且效率较低[5-6]。为提高提取效率和缩短提取时间，通过正交试验对提取条件进行优化，以期为灰树花蛋白提取提供参考。

1材料与方法

11材料与试剂

灰树花干品（来源于浙江金华）粉碎过筛备用。试剂：硫酸铵、氢氧化钠、盐酸、乙醇、磷酸（以上试剂均为分析纯），考马斯亮蓝G-250。

12仪器与设备

细胞超声粉碎机（scientz-ⅡD）、高速冷冻离心机（sigma1-15k）、紫外分光光度计（T6）。

13方法

称取一定量的灰树花干粉，一定料液比细胞超声破碎，在一定温度下碱液溶解、过滤，取上清液加硫酸铵固体（20%）→静置，离心（10000 r·min-1， 10℃，20 min）→取上清液，继续加硫酸铵固体（80%）→离心（10 000 r·min-1， 10℃，20 min），弃去上清液，留取粗蛋白，待透析完全后冷冻干燥备用。

称考马斯亮蓝G-25020 mg，溶于20 mL 95%的乙醇后，再加入85%的磷酸20 mL，稀释至100 mL。标准蛋白质溶液配制：用牛血清蛋白（BSA）配制成10 mg·mL-1标准蛋白质溶液。样品蛋白配制：取透析完全的蛋白经冷冻干燥按20 μg·mL-1，在波长595 nm下比色，测定吸光度值。

14提取工艺优化设计

141单因素试验设计干粉→水浸提→细胞破碎→碱液下溶解，分别研究A料液比（1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70）、B浸提温度（30、35、40、45、50、55、60）℃、C细胞超声破碎次数（4、5、6）、D浸提pH值（80、85、90、95、100、105、110）4个因素对提取率的影响。

陈少美等：菌草灰树花蛋白质提取工艺优化研究2018年第2期2018年第2期陈少美等：菌草灰树花蛋白质提取工艺优化研究142正交法试验设计在单因素的基础上，采用L9（34）正交试验设计料液比、浸提温度、pH值、超声破碎对蛋白质提取的影响，确定最优提取工艺条件。各因素及水平设计见下表1。

2结果与分析

21单因素试验结果

211料液比对提取率的影响从图1可知，随料液比增加，蛋白质提取率呈提高趋势，料液比在1∶40时提取率达最大值；继续增加，提取率无明显提高。说明最佳料液比区间1∶30～50。

212浸提温度对提取率的影响从图2可知，随着浸提温度升高，提取率增加，在50℃时达最大值，随后呈降低趋势。最佳浸提温度区间40～50℃。

213细胞超声破碎次数对提取率的影响由图3可知，超声次数在5次后提取率保持稳定，溶出物较完全。因此超声次数以5次为最佳。

214浸提溶液pH值对提取率的影响由图4可知，浸提pH值100时提取率达最大值，pH值 大于105提取率呈降低趋势。表明提取pH值100左右为最佳。

3结论

在单因素试验的基础上，正交试验得到灰树花子实体蛋白质提取因素对提取率影响的次序为：C>D>B>A，采用的最佳工艺条件组合为：C3D2B2A2，即料液比1∶50、浸提温度45℃、浸提pH值10、细胞超声粉碎5次，该组合下提取率达到095%。该工艺操作简便，提取效果好，可用于工业化生产。

参考文献：

[1]吴智艳，闫训友，等灰树花生理活性物质的研究进展[J]北方园艺，2006（6）：173-174

[2]NANBA H，HAMAGUCHI A，KURODA H.The chemical stmcture of an antitumor polysaccharide in fruit bodies of Grifola frondosa （maital）[J].Chem Pharm Bull，1987，35（3）：1162-1168.

[3]GU C Q，U J W，CHA0 FH，et al.Isolation，identification and function of a novel anti-HSV-l protein from Grifola frondosa[J]Antivir Res，2007，75（3）：250-257.

[4]TSAO Y W，KUAN Y C，WANG J L，et a1.Characterization of a noveI maitake（Grifola frondosa ） protein that activates nation Killer and dendritic cells and enhances antitumor immunity in mice[J].J Agr Food Chem，2013，6l（41）：9828-9838.

[5]敖宏，黄生权，陈建旭，等.赤灵芝中醇溶性蛋白提取工艺研究[J].现代食品科技，2009， 25 （6）：661-664.

[6]陈贵堂，王丽敏，姚舒愉，等.灰树花子实体多糖和蛋白的同步提取工艺优化[J].食品科技，2014，39（7）：248-251，257.