大戟苷诱导人宫颈癌Hela细胞凋亡及其作用机制研究

张德莉 李晓强 白银亮 何荣霞 吕银凤 文惠方 魏丽

中圖分类号 R285 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2018）20-2773-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.20.08

摘 要 目的：研究大戟苷对人宫颈癌Hela细胞凋亡的诱导作用及其机制。方法：取Hela细胞分为空白对照组、顺铂组（阳性对照，10 mg/L）和大戟苷低、中、高剂量组（50、100、200 mg/L），分别加入相应药物进行培养。药物作用24、48、72 h后，采用MTT法检测细胞增殖抑制率。药物作用48 h后，采用流式细胞术检测细胞凋亡率，采用Hoechst 33258染色法检测细胞核的形态变化；采用Western blot法检测细胞色素C（Cyt-C）、Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9和Caspase-10蛋白表达水平。结果：与空白对照组比较，顺铂组和大戟苷各剂量组细胞增殖抑制率和细胞凋亡率均显著升高（P<0.05或P<0.01），细胞核浓染，或有变形、缩小、碎裂，或出现凋亡小体。与空白对照组比较，大戟苷低、中、高剂量组细胞中Cyt-C、Caspase-8和Caspase-9蛋白表达水平均显著升高，Bcl-2蛋白表达水平和Bcl-2/Bax比值均显著降低（P<0.05或P<0.01）；大戟苷中、高剂量组细胞中Bax、Caspase-3和Caspase-10蛋白表达水平均显著升高（P<0.05或P<0.01）。结论：大戟苷能显著抑制Hela细胞增殖、促进细胞凋亡，其作用可能是通过激活Caspase依赖的线粒体凋亡途径来实现的。

关键词 大戟苷；宫颈癌；Hela细胞；凋亡；机制

ABSTRACT OBJECTIVE： To study induction effect of euphornin on the apoptosis of cervical cancer Hela cells and its mechanism. METHODS： The cervical cancer Hela cells were divided into blank control group， cisplatin group （positive control， 10 mg/L） and euphornin low-dose， medium-dose and high-dose groups （50， 100， 200 mg/L）. They were treated with relevant medicine. The inhibitory effect of Hela cells proliferation was tested by MTT assay after 24， 48， 72 h of medicine treatment. The apoptotic rate of Hela cells was measured by flow cytometry after 48 h of medicine treatment. Morphology of nucleus was detected by Hoechst 33258 staining. The protein expression of Cyt-C，Bcl-2，Bax，Caspase-3，Caspase-8，Caspase-9 and Caspase-10 were detected by Western blot assay. RESULTS： Compared with blank control group， inhibitory rate of cell proliferation and cell apoptosis rate were increased significantly in cisplatin group and euphornin groups （P<0.05 or P<0.01）， and obvious staining， deformation， shrinking， fragmentation or apoptotic bodies was found in nucleus. Compared with blank control group， the protein expression levels of Cyt-C， Caspase-8 and Caspase-9 in euphornin low-dose， medium-dose and high-dose groups were increased significantly， while the protein expression level of Bcl-2 and Bcl-2/Bax ratio were decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）； the protein expression levels of Bax，Caspase-3 and Caspase-10 in euphornin medium-dose and high-dose groups were increased significantly （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： Euphornin can significantly inhibit the proliferation of Hela cell and promote cell apoptosis， the effect of which will be achieved by activating the Caspase-dependent mitochondrion apoptosis pathway.

KEYWORDS Euphornin；Cervical cancer；Hela cell；Apoptosis； Mechanism

宫颈癌是女性最常见的妇科恶性肿瘤之一，发病率在全球女性肿瘤中居第3位，严重威胁女性健康[1]。泽漆是大戟属植物泽漆（Euphorbia helioscopia L.）的干燥全草，其作为民间验方的重要组成部分用于治疗宫颈癌、食道癌等表现出一定疗效，因此其抗肿瘤活性引起了研究者的广泛关注[2-3]。近年来，有研究者对泽漆的不同溶剂提取物进行了抗肿瘤活性筛选，发现其对多种肿瘤细胞均有一定的抑制作用[2-4]。以往研究显示，泽漆的乙酸乙酯、石油醚、氯仿等萃取液对肝癌SMMC7721细胞、HepG2细胞，胃癌SGC7901细胞和肺癌A549细胞均有显著的增殖抑制作用，其机制可能是通过线粒体途径诱导肿瘤细胞凋亡[5-8]。目前的研究大多是针对泽漆的提取混合物，对其单体活性成分的研究较少。只有Chen H等[9]于2012年首次研究了泽漆的二萜酯类单体活性成分之一大戟苷（Euphornin）的细胞毒作用，结果发现其对肺腺癌LA795细胞增殖具有显著的抑制作用，因此提出大戟苷是泽漆提取物发挥抗肿瘤作用的最关键组分之一，但并未对其抗肿瘤作用机制作进一步研究。基于此，本课题组拟研究大戟苷诱导人宫颈癌Hela细胞凋亡的作用及其机制，为大戟苷临床上用于宫颈癌的治疗提供实验基础。

1 材料

1.1 仪器

BB15型CO2细胞培养箱（美国Thermo Scientific公司）；Synergy H1型全功能酶标仪（美国BioTek公司）；IX51型荧光显微镜（日本Olympus公司）；FACS Calibur型流式细胞仪（美国BD公司）；DYY-Ⅲ型电泳仪、DYY-Ⅲ型电泳槽（北京六一实验仪器厂）；Z216K型高速冷冻离心机（德国Hermle 公司）。

1.2 药品与试剂

大戟苷（兰州大学天然药物化学教研室，批号：20151121，纯度：≥98%）；顺铂注射液（江苏豪森药业股份有限公司，批号：160508，规格：30 mg/6 mL）；四甲基偶氮唑蓝（MTT）、Hoechst 33258染色试剂盒、Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒、ECL化学发光试剂盒（碧云天生物技术研究所）；鼠抗人细胞色素C（Cyt-C）、Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-10、β-actin单克隆抗体和辣根过氧化物酶标记兔抗鼠二抗（美国Santa Cruz公司）；BCA蛋白定量分析试剂盒、胎牛血清、DMEM培养基、双抗（青霉素-链霉素）、磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）[赛默飞世尔科技（中国）有限公司]；水为双蒸水。

1.3 细胞

人宫颈癌Hela细胞株由中国科学院上海细胞库提供。

2 方法

2.1 细胞培养

取Hela细胞，在含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL 链霉素的DMEM培养基（以下简称“DMEM培养基”）中，于37 ℃、5%CO2条件下培养。待细胞生长至对数生长期时取出用于试验。

2.2 细胞增殖抑制率检测

采用MTT法检测。将Hela细胞以5×104个/孔接种于96孔培养板，在37 ℃、5%CO2条件下培养24 h；将细胞分为空白对照组、顺铂组（阳性对照）和大戟苷低、中、高剂量组，分别加入含相应药物的DMEM培养基。根据文献[9]，大戟苷低、中、高剂量组的药物终质量浓度分别为50、100、200 mg/L；顺铂组的药物终质量浓度为10 mg/L；空白对照组加入等体积的不含药DMEM培养基。加药后继续培养24、48、72 h。每组细胞均设6个复孔平行操作。培养完毕后收集细胞，以MTT染色液染色，采用酶标仪在492 nm波长处检测吸光度（OD值），计算大戟苷对Hela细胞的增殖抑制率。细胞增殖抑制率（%）=（1-试验组OD值/对照组OD值）×100%。试验重复3次。

2.3 细胞凋亡率检测

采用流式细胞术检测。将Hela细胞以1×105个/孔接种于6孔培养板中，在37 ℃、5%CO2条件下培养24 h；按“2.2”项下方法进行分组及加入相应药物；继续培养48 h后收集细胞，用预冷的PBS洗涤2次；按照Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒说明书操作，采用流式细胞仪检测细胞凋亡率。试验重复3次。

2.4 细胞核形态观察

采用Hoechst 33258染色法检测。按“2.3”项下方法取Hela细胞接种、培养、分组及加入相应药物；继续培养48 h后收集细胞并制成细胞悬液（1×104个/mL）；按照Hoechst 33258染色试剂盒说明书操作后，于荧光显微镜下观察Hela细胞核形态并对图像进行分析。鏡下可见细胞呈蓝色荧光；凋亡细胞的细胞核浓染，或有变形、缩小或碎裂，或出现凋亡小体。

2.5 细胞中凋亡相关蛋白表达水平检测

采用Western blot法检测。按“2.3”项下方法取Hela细胞接种、培养，分为空白对照组（不含药DMEM培养基）和大戟苷低、中、高剂量组（终质量浓度分别为50、100、200 mg/L），加入相应药物；继续培养48 h后加入含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液冰浴裂解25 min，收集细胞，在4 ℃条件下15 000 r/min离心25 min，取上清，采用BCA法进行总蛋白定量，-80 ℃保存备用。蛋白采用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离，转膜，5%脱脂奶粉封闭2 h后，加入一抗（Cyt-C、Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-10、β-actin，稀释度均为1 ∶ 1 000），4 ℃孵育过夜，然后加入二抗室温孵育2 h，电化学发光法显色。以β-actin为参比，采用Image Pro Plus 6.0软件分析目标条带的相对灰度值，以表示蛋白表达水平。试验重复3次。

2.6 统计学方法

数据以均数±标准差（x±s）表示。应用SPSS 15.0软件对多组间比较进行单因素方差分析，对组间两两比较进行LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 大戟苷对Hela细胞增殖的影响

与空白对照组比较，顺铂组和大戟苷低、中、高剂量组细胞加入相应药物作用24、48、72 h后，细胞增殖抑制率均显著升高，差异均有统计学意义（P<0.01），表明不同剂量的大戟苷对Hela细胞增殖均有显著的抑制作用。各组细胞增殖抑制率比较见表1。

3.2 大戟苷对Hela细胞凋亡的影响

与空白对照组比较，顺铂组和大戟苷低、中、高剂量组细胞加入相应药物作用48 h后，细胞凋亡率均显著升高，差异均有统计学意义（P<0.01），表明不同剂量的大戟苷均能够诱导Hela細胞发生凋亡。各组细胞的流式细胞图见图1，细胞凋亡率比较见表2。

3.3 大戟苷对Hela细胞核形态的影响

荧光显微镜下可见，与空白对照组比较，顺铂组细胞的细胞核出现明显的浓染、碎裂和凋亡小体；大戟苷低、中、高剂量组细胞的细胞核有不同程度的浓染或变形、缩小、碎裂，其中大戟苷中、高剂量组细胞出现凋亡小体。这表明大戟苷可剂量依赖性促进Hela细胞发生凋亡。各组细胞的细胞核形态显微图见图2。

3.4 大戟苷对Hela细胞中凋亡相关蛋白表达的影响

与空白对照组比较，药物作用48 h后，大戟苷低、中、高剂量组细胞中Cyt-C、Caspase-8和Caspase-9蛋白表达水平均显著升高，Bcl-2蛋白表达水平和Bcl-2/Bax比值均显著降低；大戟苷中、高剂量组细胞中Bax、Caspase-3和Caspase-10蛋白表达水平均显著升高，以上差异均有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。各组细胞中凋亡相关蛋白电泳图见图3，蛋白表达水平比较见表3。

4 讨论

本课题组在预试验中考察了大戟苷对正常细胞系MRC-5细胞和人宫颈癌Hela细胞增殖的抑制作用，结果发现不同剂量的大戟苷（50、100、200 mg/L）均能显著抑制Hela细胞增殖，但对MRC-5细胞未表现出明显的增殖抑制作用。因此，本研究采用上述剂量进行试验。

线粒体凋亡途径是细胞凋亡最主要的途径之一，通常凋亡信号能引起线粒体的通透性转换孔（PT）开放，导致线粒体跨膜电位下降和Cyt-C释放进入细胞质[10]。作为凋亡诱导因子，Cyt-C能与凋亡酶激活因子（Apaf-1）、Caspase-9前体、腺嘌呤核糖核苷酸/腺嘌呤脱氧核糖核苷酸（ATP/dATP）形成凋亡体，然后募集并激活Caspase-3，进而诱发Caspase家族级联反应，最终导致细胞凋亡[11-13]。同时，Bcl-2家族蛋白能够调节PT孔的开放和关闭：促凋亡蛋白Bax可通过与PT孔的腺苷转位因子（ANT）和电压依赖性阴离子通道（VDAC）结合介导PT孔的开放，继而发挥其促凋亡效应；而抗凋亡蛋白Bcl-2则可通过与Bax竞争性地结合ANT或VDAC，继而发挥其抗凋亡效应[14-16]。本研究结果显示，大戟苷能显著诱导Hela细胞发生凋亡，升高Cyt-C、Bax蛋白表达水平，降低Bcl-2蛋白表达水平。这提示大戟苷能诱导Cyt-C向细胞质释放，从而启动线粒体凋亡途径。

Caspase蛋白家族属于半胱氨酸蛋白酶，是诱发细胞凋亡的关键酶，一旦被激活即能降解细胞内的蛋白质，导致细胞发生不可逆的死亡[17]。Caspase蛋白通常分为两类：一类是启动者，如Caspase-8、Caspase-9和Caspase-10，它们能通过自催化或自剪接的方式被激活，继而引起Caspase家族级联反应；另一类是执行者，如Caspase-3、Caspase-6和Caspase-7，它们可直接降解细胞内结构蛋白和功能蛋白，引起细胞凋亡，但不能通过自催化或自剪接的方式被激活[18]。通常当Cyt-C过度释放进入细胞质后，Caspase-8、Caspase-9和Caspase-10接受凋亡信号后通过异源活化方式激活下游Caspase信号，将凋亡信号级联放大，被异源活化的Caspase-3等最终执行细胞死亡程序[19-20]。本研究结果显示，大戟苷能显著升高Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9和Caspase-10蛋白表达水平。这进一步提示大戟苷能通过启动线粒体凋亡途径而诱导Hela细胞凋亡。

综上所述，大戟苷能显著抑制Hela细胞增殖、促进细胞凋亡，其作用可能是通过激活Caspase依赖的线粒体凋亡途径来实现的。

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（收稿日期：2018-04-25 修回日期：2018-08-24）

（編辑：段思怡）