电针对APP/PS1转基因小鼠海马P-糖蛋白和间质液β淀粉样蛋白水平的影响

周英奕 高誉珊 李丽娜 毛颖秋 张磊 张学婷 裴亚妮 薛卫国

摘要 目的：通過观察电针对于APP/PS1双转基因小鼠海马P-糖蛋白表达和脑间质液Aβ水平的影响，探讨电针治疗阿尔茨海默病的作用机制。方法：12只4月龄雄性APP/PS1转基因鼠，随机分为电针组和模型组;6只4月龄雄性C57BL鼠为正常对照组。电针“百会”“涌泉”2周后，采用脑微透析检测技术取小鼠脑间质液，Elisa法检测小鼠间质液Aβ水平;免疫组化法观察小鼠海马P-糖蛋白表达情况。结果：免疫组化结果显示，与正常对照组比较，模型组P-糖蛋白表达明显减少;与模型组比较，电针组的表达相对增加。ELISA检测显示，与正常对照组比较，模型组的间质液Aβ明显减少;与模型组比较，针刺组Aβ水平明显下降。结论：电针可以降低脑间质液Aβ水平，并可以升高海马内P-糖蛋白的表达。

关键词 阿尔茨海默病;β淀粉样蛋白;APP/PS1转基因小鼠;脑组织间液;P-糖蛋白;电针

Effects of Electroacupuncture at Baihui （DU 20） and Yongquan （KI 1） on P-glycoprotein

and Brain Interstitial Fluid β-amyloid in Hippocampus in APP/PS1 Transgenic Mice

Zhou Yingyi1， Gao Yushan2， Li Li′na2， Mao Yingqiu2， Zhang Lei1， Zhang Xueting1， Pei Yani1， Xue Weiguo1

（1 School of Acupuncture， Moxibustion and Tuina， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China;

2 School of Chinese Medicine， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China）

Abstract Objective：To observe the effect of electroacupuncture on the level of P-glycoprotein and brain interstitial fluid Aβ in hippocampus in APP/PS1 transgenic mice， and to explore the mechanism of electroacupuncture in the treatment of Alzheimer′s disease. Methods：Twelve male APP/PS1 transgenic mice were divided into electroacupuncture group and model group randomly. Six male C57BL mice were used as normal control group. The level of Aβ in the interstitial fluid of mice was detected by Elisa method after two weeks of electroacupuncture at Baihui （DU 20） and Yongquan （KI 1）. The expression of P-glycoprotein in hippocampus was observed by immunohistochemistry. Results：Immunohistochemical results showed that the expression of P-glycoprotein was significantly decreased （P<0.01） in the model group when compared with the normal control group， and the expression of P-glycoprotein in the EA group was significantly increased （P<0.05） compared with the model group. ELISA test showed that the level of brain interstitial fluid Aβ in the model group was lower （P<0.01） than the level in the control group significantly. Compared with the model group， the level of Aβ in the acupuncture group was significantly decreased （P<0.01）. Conclusion：Electroacupuncture can decrease the level of brain interstitial fluid Aβ and increase the expression of P-glycoprotein in hippocampus， which may explain why the EA have effects on AD.

Key Words Alzheimer′s disease; β-amyloid; APP/PS1 transgenic mice; Brain interstitial fluid; P-glycoprotein; Electroacupuncture

中图分类号：R277.7文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.03.040

阿尔茨海默病（Alzheimer′s Disease，AD）是一种慢性进行性疾病，是痴呆最常见的一种类型，主要临床表现为认知功能障碍、渐进性记忆障碍等神经精神症状。AD的主要病理特征是由β淀粉样蛋白（β-Amyloid，Aβ）沉积导致形成的老年斑块（Senile Plaques，SP）堆积[1-2]。Aβ级联学说是目前国际较为公认的AD发病学说[3]，该学说认为脑中Aβ的生成与清除失衡导致的沉积，是形成淀粉样斑块的原因[4]。

研究认为Aβ在神经元外的沉积对神经元产生的损伤和破坏，是导致记忆AD病理改变的原因之一[5]。目前研究的靶点是通过降低脑内Aβ水平，减轻其神经毒性，缓解疾病进程。脑中的Aβ主要分为可溶性和不可溶性2种形式。脑组织间液（Brain Interstitial Fluid，ISF）是一个中间过程，可溶性Aβ由此进入不同代谢场所从而被进一步清除，因此观测ISFAβ的含量对于脑内Aβ清除效果的评估具有重要意义[6]。脑内Aβ清除主要通过血-脑屏障（Blood-brain Barrier，BBB）途径转运，P-糖蛋白主要分布于P-糖蛋白主要分布在脑毛细血管内皮细胞（BCECs）上，研究表明其是转运Aβ外流出脑的重要载体，对Aβ水平的变化产生重要影响[7-8]。

本实验选择APP/PS1双转基因鼠，采用“益腎祛浊”法[9]，对“百会”“涌泉”两穴进行电针治疗，观察其对间质液Aβ水平的影响;取样海马组织，观察P-糖蛋白在该区域的表达，从而探讨电针作用在AD疾病上的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 4月龄、雄性C57 BL鼠6只作为正常对照组;4月龄、雄性APP/PS1转基因鼠12只作为模型组和针刺干预组。动物从南京大学模式动物研究所购入。

1.1.2 试剂与仪器 人Aβ42Elisa超敏试剂盒（美国，Life technologies公司，KHB3544）;P-糖蛋白兔单克隆抗体（美国，Abcam，ab170904），免疫组化超敏试剂盒（兔）（迈新生物科技，KIT-9706）;DAB显色试剂盒（迈新生物科技，DAB-0031）;无菌针灸针（中研太和，0.25 mm×13 mm）;韩氏穴位神经刺激仪（北京华卫产业开发公司，HANs LH202H型）。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 4月龄、雄性APP/PS1转基因鼠12只随机等分为2组：电针观察组（A）和模型组（M）;4月龄、雄性C57BL鼠6只作为正常对照组（C）。实验已被北京中医药大学实验动物伦理委员会通过。

1.2.2 针刺干预方法 电针观察组的小鼠取俯卧位，使用自制鼠袋束缚，将其放置于治疗台上，根据大鼠针灸穴位图谱以及比较解剖学的方法选穴定位，在头顶正中取“百会”穴，平刺3～5 mm;在足底的前、中1/3交界处取“涌泉”穴，平刺5～7 mm。电针正、负极分别接左、右侧“涌泉”穴，频率为1/50 Hz，采用疏密波，强度约0.3 Ma。以动物状态稳定、不剧烈挣扎嘶叫为度。治疗的时间为15 min，隔日针刺，共2周。正常对照组、模型组仅不进行针刺，其他条件均相同，用相同的自制鼠袋束缚，放置于治疗台上，束缚时间为15 min，隔日1次，共2周[10]。

1.2.3 检测指标与方法

1.2.3.1 脑微透析取脑间质液（ISF）及ELISA检测  麻醉小鼠后，进行手术，将微透析探针放置于小鼠左侧海马C3区域处，探针（MAB公司，13.8.1）膜长为1 mm，膜截流分子量为10KD。夜间观察小鼠的生命状态良好，活动正常，于第2天将其送入CMA/120活动装置，小鼠可在清醒状态下在装置内自由活动，方便进行长时间的微透析取样，小鼠在运动过程中微透析探针所连接的细管不影响其活动。探针与CMA微量取样系统通过细管连接，内外压平衡1 h后，开始取样脑间质液[11]。CMA微量取样系统采用0.5 μL/min的灌流速度，灌流替代液为不含蛋白的人工脑脊液，每隔1 h得到1管透析液样品。每只小鼠取4管脑组织间液，第1 h样品为平衡内外压时的取样，故舍弃。

用人Aβ42Elisa试剂盒（美国，Life technologies公司，96T，KHB3544）检测脑间质液Aβ42的含量。提前配置好标准品，浓度分别为100 pg/mL、50 pg/mL、25 pg/mL、12.5 pg/mL、6.25 pg/mL、3.13 pg/mL、1.56 pg/mL以及0 pg/mL（仅标准品稀释液）;ELISA检测板第一排每孔只放入浓度依次递减的标准品25 μL和25 μL稀释液覆膜封板，其余每排各孔均加入25 μL待测样品和25 μL稀释液覆膜封板，于室温下静置孵育3 h。用1X的洗涤缓冲液洗板4次。每孔加入100 μL二抗（空白对照的空孔除外），覆膜封板，于室温下静置孵育30 min。1X的洗涤缓冲液充分洗板4次。每孔加显色剂100 μL，轻震混匀，室温下避光孵育30 min。每孔加入100 μL的终止液。酶标仪测吸光值，设定检测波长为450 nm。用Excel软件绘制蛋白标准品的曲线，根据计算出来的方程式计算样品中Aβ42的浓度，再根据样品稀释情况换算海马脑间质液中Aβ42的浓度。

1.2.3.2 脑组织取样及免疫组化 取小鼠右侧半脑，放置于4%多聚甲醛的磷酸盐缓冲液（PBS），固定7 d。自来水流水冲洗后修块，用石蜡包埋，从视交叉处开始，于冠状轴切片，厚度为6 μm，1只小鼠切10～15张片。选取海马结构完整且位于水平位的切片，进行免疫组化ABC法[11]。

免疫组化法具体操作步骤：脱蜡（二甲苯15 min，2次;100%无水乙醇5 min，2次;95%、90%、80%、70%乙醇依次浸泡切片5 min，均1次）;枸橼酸盐缓冲液热修复抗原10 min;待恢复至室温，PBS洗板3次;50 μL过氧化酶阻断溶液（迈新生物科技，KIT-9706，A液）室温孵育10 min;PBS洗板3次;山羊血清封闭液（迈新生物科技，KIT-9706，B液）孵育10 min;用滤纸吸干山羊血清，加兔抗鼠P-gp（美国，Abcam，ab170904）一抗以1：100稀释，4 ℃孵育过夜;次日，PBS洗板5次，加入二抗（迈新生物科技，KIT-9706，C液）室温孵育10 min，PBS洗板;再加入三抗（迈新生物科技，KIT-9706，D液）。PBS洗板3次，加入DAB显色10 min;自来水充分冲洗后，苏木素复染40 s;自来水浸泡5 min，脱水（70%、80%、90%、95%乙醇各5 min浸泡清洗，100%无水乙醇清洗5 min，共2次;100%二甲苯10 min，共2次）、树脂封片。使用DXM1200相机，用Leica系统连接并采集图像。

使用Leica图像采集系统，取每只小鼠的1张免疫组化染色后的切片，在400倍放大下，取小鼠海马内相同的3个视野拍照;采集图片后，用Imagine Pro Plus（IPP）软件算出每张图片海马区域内P-糖蛋白的积分光密度（IOD）总和，取每只动物所有图片IOD的平均数，用此数据表示P糖蛋白的表达情况，进行统计学析。

1.3 统计学方法 采用SPSS 20.0软件，对脑组织间液Aβ的ELISA检测结果和海马P-糖蛋白的免疫组化检测结果进行统计学结果分析。各组数据均服从正态分布，方差齐，故采用单因素方差ANOVA分析法;用LSD方法进行两两比较，分析各组间数据。以P<0.05为差异有统计学意义;P<0.01为差异有显著统计学意义。

2 结果

2.1 ELISA检测间质液Aβ水平 脑微透析取样各组小鼠海马脑间质液，用ELISA法检测其Aβ1-42水平。经统计学分析，模型组高于正常对照组（P<0.01）;电针组低于模型组（P<0.01）。见表1。

表1 电针对于各组间质液Aβ1-42水平的影响（±s）

注：与正常对照组比较，**P<0.01;与模型组比较，△△P<0.01

2.2 免疫组化法检测P-糖蛋白 在海马相同区域内，观察P-糖蛋白表达情况，3组均存在P-糖蛋白阳性表达，且均表达于微血管壁上。正常对照组阳性表达面积最大，且颜色较深;模型组阳性表达面积明显减少，颜色也明显变浅;与模型组比较，电针观察组阳性表达面积有所增加。见图1。采用IPP软件对P-糖蛋白的阳性表达IOD值进行半定量分析。两两比较可得，模型组海马的P-糖蛋白IOD值大于正常对照组，差异有统计学意义（P<0.01）;电针观察组海马P-糖蛋白IOD大于模型组（P<0.05）。见表2。

图1 小鼠海马P-糖蛋白表达情况（免疫组化×400）

表2 各组小鼠海马P-糖蛋白积分光密度（IOD）比较

注：与正常对照组比较，**P<0.01;与模型组比较，△P<0.05

3 讨论

Aβ血管清除理论认为脑内Aβ的清除主要是通过BBB转运的。Aβ经血脑屏障转运入血包括两步，即分别透过脑毛细血管内皮细胞（BCECs）细胞膜的基底侧和基顶侧，且这两步都需经过特异性的转运体或受体介导[12]。在BBB中，P-糖蛋白主要分布在脑毛细血管内皮细胞（BCECs）与血液循环接触的腔面上，也就是BCECs的基顶部位[13-14]，是Aβ转运出脑的重要转运载体[15-16]。

脑组织间液（ISF）是Aβ进入不同代谢途径的中间场所。在AD发病的早期阶段，脑组织中的Aβ大多存在于脑组织细胞间液（ISF），为可溶性形式，另一部分存在于脑组织中。随着AD疾病的进一步发展，可溶性Aβ经由血管途径的清除能力逐渐下降，逐渐在脑中聚集、变性成不溶性Aβ形式，进一步沉积于脑血管壁形成脑血管淀粉样变，这也是老年斑块形成的主要原因。且研究表明，间质液Aβ水平对AD的干预早期较晚期有更明显的效果[17]。因此，选择4月龄的APP/PS1转基因鼠，排除了老年斑生成对于可溶性Aβ水平的影响，在前期观察电针对于间质液中可溶性Aβ水平的影响。近年来，越来越多的研究[18-19]采用脑微透析技术取样，用于监测脑内Aβ水平的变化，其优势是可进行在体、实时的取样，且不干扰体内的正常生命活动[20]。

Aβ是由淀粉樣前体蛋白（APP）经分泌酶切割而生成的，APP/PS1双转基因动物模型就是转入了过度表达的人类基因APP和早老素1（PS1），因此过度生成的APP蛋白和分泌酶（于PS1基因相关），使脑内Aβ的生成增加。表1的结果也证实了相对于正常对照组，模型组的Aβ水平显著增加，从而证实了APP/PS1模型选择的正确性;Aβ的清除与其转运蛋白的能力密切相关，因此通过对重要转运蛋白P-糖蛋白水平的观察，反映了APP/PS1鼠清除水平较C57BL鼠减低，从而导致老年斑块的生成增多和出现的时间提前[21]，其神经毒性继而引发一系列病理变化。故该模型能较好地模拟AD发病。

中医认为AD的病位在脑，“血瘀痰阻”是其发病的主要病因病机。针刺“百会”“涌泉”2穴，上下相配，远近相应，起到扶正固本、通络祛浊的作用。通过对间质液Aβ水平变化的观察，实验证明转基因模型鼠海马脑间质液Aβ42水平大幅度增高，而电针能明显降低脑间质液Abeta42水平。其降低可能由于电针降低了Aβ42生成或增加了Aβ42的清除。电针后P-糖蛋白水平的提高，说明经P-糖蛋白的脑微血管壁从脑间质液向外周血液的Aβ42清除，可能在降低脑间质液Aβ42水平中发挥一定的作用。

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