基于Notch信号通路探讨针刺曲池、足三里对MCAO大鼠的神经保护机制

于雪萍 袁秀丽

摘要 目的：觀察针刺曲池穴及足三里穴对MCAO大鼠的行为学干预效应，同时评价其对Notch信号通路标志性蛋白的影响。方法：将36只SD大鼠随机分成空白组、模型组及针刺组，各12只。模型组及针刺组大鼠均接受改良线栓法建立左侧大脑中动脉局灶性缺血（MCAO）再灌注模型，空白组大鼠仅进行血管分离术，术后空白组及模型组大鼠每日接受模拟捉拿1次，针刺组大鼠予针刺曲池穴及足三里穴，连续干预14 d，用神经行为学评分评估大鼠行动能力，TTC染色法观察脑梗死体积变化，HE染色法观察大鼠脑组织细胞形态和结构，Western blotting法检测各组大鼠脑组织Notch1、Hes1蛋白表达变化。结果：1）与模型组比较，针刺组大鼠神经行为学评分明显提高，并缩小了脑梗死体积;2）针刺可明显改善MCAO术大鼠脑组织细胞形态和结构;3）Western blot结果显示针刺可明显上调大鼠脑组织Notch1、Hes1的蛋白水平。结论：电针曲池穴及足三里穴可改善MCAO大鼠行为能力，其作用机制可能与介导Notch通路有关。

关键词 局灶性脑缺血;针刺;曲池穴;足三里穴;Notch信号通路

Mechanism for Neuroprotection against MCAO Rats of Acupuncturing at Quchi （LI 11）

and Zusanli （ST 36） based on Notch Signaling Pathway

Yu Xueping1， Yuan Xiuli2

（1 Sichuan College of Traditional Chinese Medicine， Mianyang 621000， China; 2 Mianyang City Hospital

of Traditional Chinese Medicine， Mianyang 621000， China）

Abstract Objective：To observe the behavioral effects of acupuncture at Quchi （LI 11） and Zusanli （ST 36） acupoints on MCAO rats and to evaluate the effects on Notch signaling pathway marker proteins. Methods：A total of 36 SD rats were randomly divided into blank group， model group and acupuncture group， with 12 rats in each group. The rats in the model group and the acupuncture group received the modified suture method to establish the model of left middle cerebral artery occlusion （MCAO） reperfusion. The rats in the blank group were only subjected to vascular segmental surgery. The postoperative blank control group and model group rats were subjected to simulated catching once a day. Rats in acupuncture group were given acupuncture at Quchi and Zusanli points for continuous intervention for 14 days. Neurobehavioral scores were used to assess the ability of rats to exercise. TTC staining was used to observe changes of cerebral infarction volume. HE staining was used to observe morphology and structure of rat brain cells. The expression of Notch1 and Hes1 protein in brain tissue of each group was detected by Western blotting. Results：1） Compared with the model group， neurobehavioral score of acupuncture group was significantly increased and the volume of cerebral infarction was reduced; 2） Acupuncture significantly improved the morphology and structure of brain cells in MCAO rats; 3） Western blotting results showed that acupuncture significantly increased the protein levels of Notch1 and Hes1 in rat brain. Conclusion：Electroacupuncture at Quchi and Zusanli points can improve the behavioral abilities of MCAO rats， which may be related to the mechanism of Notch pathway.

Key Words Focal cerebral ischemia; Needling; Quchi （LI 11）; Zusanli （ST 36）; Notch signal pathway

中图分类号：R245.3文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.03.037

运动功能障碍是缺血性脑卒中最常见的后遗症，严重制约了患者日常生活及工作能力，大量动物及临床研究[1-4]均证实刺激曲池穴及足三里穴可明显改善脑卒中的运动功能，但其机制尚未完全阐明。分子生物学是近年来研究针刺作用机制的热点，有资料显示Notch信号通路在脑组织缺血时可被激活，从而调控缺血后神经的再生及修复过程，实现了神经保护效应，由此，针刺曲池穴及足三里穴改善脑卒中病情的机制是否通过Notch信号通路介导？我们建立了MCAO大鼠模型模拟临床缺血性脑卒中，证实电针曲池穴及足三里穴确可明显改善MCAO大鼠的神经行为学能力，我们亦进行一系列分子生物学技术检测，以期探讨其作用机制，报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 36只清洁级SD大鼠均购自上海斯莱克实验动物责任有限公司，鼠龄10～12周，平均（11.23±0.24）周，体重220～280 g，平均（250.42±4.23）g。

1.1.2 主要试剂及仪器 10%水合氯醛（青岛宇龙海藻有限公司），液氮（凯福达化工有效公司），环球牌不锈钢毫针（苏州针灸用品有限公司）、2%TTC染色液（Solarbio公司）、Notch1一抗（CST公司）、Hes1一抗（CST公司）、-actin抗體（CST公司）。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 1）分组：适应性饲养7 d后对36只大鼠进行随机数字编号，造模后将造模大鼠随机分为模型组及针刺组，各组均12只大鼠。3组大鼠在鼠龄、体重等方面差异无统计学意义（P>0.05），可进行比较。2）模型制备[5]：适应性饲养7 d后禁食不禁水12 h，称重后使用10%水合氯醛以0.3 mL/kg比例对各组大鼠进行充分麻醉，参照Zea-Longa法进行MCAO模型制备，将大鼠固定于手术台上于颈部正中处切开皮肤，左侧颈总动脉充分暴露于术者视野中，使用显微镊逐步分离出颈内动脉及颈外动脉，并于颈内动脉及颈外动脉分叉口处对颈外动脉进行充分结扎，随后用血管夹夹闭颈内动脉，在颈内动脉做一切口插入线栓，随后取出血管夹至线栓插入约2.0 mm为度，随后缝合皮肤。空白组大鼠仅进行皮肤切开及血管分离术后缝合皮肤。所有大鼠均注意保暖。

1.2.2 干预方法 造模次日对针刺组大鼠进行电针曲池穴及足三里穴，穴位定位参考李忠仁主编的《实验针灸学》，针刺深度达到约6 mm时接入电针仪，选用疏密波，频率2～10 Hz，以大鼠肢体轻微抖动为度，30 min/次，1次/d。空白组及模型组大鼠均仅接受模拟捉拿，1次/d。连续干预14 d后处死所有大鼠，并进行取材。

1.2.3 检测指标与方法

1.2.3.1 神经行为学评分 对大鼠神经缺损症状进行评估，具体如下：大鼠未出现任何神经缺损症状视为0分;造模后大鼠出现右侧肢体伸展不利视为1分;造模后大鼠行走时向右侧转圈视为2分;造模后大鼠行走时向右倾倒视为3分;造模后大鼠无法行走视为4分。

1.2.3.2 TTC染色 利用TTC染色法对各组大鼠脑梗死体积的测量，各组大鼠干预结束后处死取出脑组织，均匀切成厚度约2 mm的脑片，利用2，3，5-氯化三苯基四氮唑进行染色，正常脑组织可与2，3，5-氯化三苯基四氮唑进行脱氢酶反应最终显示鲜红色，而梗死脑区域因无法进行脱氢酶反应或者反应减弱而呈现白色。利用Image-Pro Plus 6.0分析软件对白色区域进行计算，得出脑梗死体积百分比（%）=（脑片白色区域面积总和×2 mm）/全脑片面积×2 mm×100%。

1.2.3.3 HE染色 于腹主动脉注入4%的多聚甲醛进行脑组织灌流固定，冰上取出脑组织后均匀分成4等份，分别置于70%、80%、95%、100%梯度乙醇液体中进行脱水，再用二甲苯透明，再用石蜡进行包埋，待蜡块充分冷却后切成厚度约5 μm薄片，固定于载玻片上备用。随后将切片固定10～30 s，再用苏木精-伊红染色，采用光学显微镜对样本进行读取。

1.2.3.4 Western blot 充分麻醉后取出左侧脑组织约100 mg，加入蛋白裂解液充分裂解后将样本置于4 ℃、14 000 g/min条件下离心10 min，抽取上清液，利用BCA试剂盒进行蛋白浓度测定并计算出各组上样量。将上述总蛋白分装于1.5 mL EP管中，在100 ℃水浴中煮沸变性5 min，充分冷却后根据事先计算的上样量加至SDS-PAGE凝胶孔道中，80 V恒压电泳，再用PVDF膜转膜目标蛋白，再用5%脱脂奶粉进行封闭2 h，再分别加入一抗（羊抗Notch1 1∶1 000，羊抗Hes1 1∶1 000，β-actin 1∶1 000），孵育过夜，随后用TBST洗涤3次，5 min/次，再用HRP标记的二抗（1∶5 000）室温反应2 h，加入ECL显影液，反应60 s后于显影仪器中进行条带扫描，得出灰度值。

1.3 统计学方法 采用SPSS 22.0统计软件进行数据分析，所有数据运用均数±标准差（±s）表示，数据符合正态分布使用t检验，偏态分布采用秩和检验，检验标准为α=0.05，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 电针曲池穴及足三里穴可降低MCAO大鼠神经行为学评分 接受造模的2组大鼠神经行为学评分均明显升高，进行为期14 d干预后，针刺组大鼠神经行为学评分明显提高，与模型组比较差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

表1 各组大鼠神经行为学评分比较（±s，分）

注：组内比较，*P<0.05;与模型组干预第14天比较，△P<0.05

2.2 电针曲池穴及足三里穴可缩小MCAO大鼠脑梗死体积 接受造模的2组大鼠脑组织可见明显白色区域，进行为期14 d干预后，针刺组大鼠区域较模型组明显缩小，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2、图1。

表2 各组脑梗死体积比较（±s，%）

注：组内比较，*P<0.05，与模型组干预第14天比较，△P<0.05

图1 各组大鼠脑片TTC染色结果

2.3 电针曲池穴及足三里穴可明显改善MCAO大鼠脑组织结构及形态 空白组大鼠脑组织细胞排列整齐有序，细胞核完整。模型组大鼠脑片可见神经元细胞排列错乱及皱缩，存在明显坏死现象;针刺组大鼠脑组织部分神经元细胞结构尚可，排列较模型组整齐，部分神经元细胞出现浓染。见图2。

图2 各组MCAO大鼠脑组织结构及形态

2.4 电针曲池穴及足三里穴可明显改善上调MCAO大鼠脑组织Notch1、Hes1蛋白浓度 使用Western blot法对各组大鼠脑组织Notch1、Hes1的蛋白水平进行检测，结果发现MCAO术后模型组及针刺组大鼠Notch1、Hes1的蛋白表达均降低，与空白组比较差异有统计学意义（P<0.05）。经过14 d干预后针刺组大鼠Notch1、Hes1的蛋白水平有所上调，与模型组比较差异有统计学意义（P<0.05）。见图3。

图3 各组大鼠Western blot結果

3 讨论

脑卒中属于古籍中“中风”“痿证”等范畴，认为脑脉痹阻、脑髓失养使其主要病机，由此导致半身不遂等诸症[6-8]。此病病位在头部，《景岳全书》曰：“凡病此者……阴亏于前而阳损于后……以致阴阳相失，……卒然仆倒”，《灵枢·根结》亦记载：“太阳为开，阳明为合，少阳为枢……合折则气所止息，而痿疾起矣。故痿疾者，取之阳明”，故调节阳明经是治疗脑卒中的关键。曲池穴为手阳明大肠经合穴，足三里是足阳明胃经合穴，两穴均是阳明经要穴，乃阳明经气汇聚之所，故使用二穴治疗脑卒中由来已久，正如《针灸逢源·中风门》中认为：“瘫痪，此由将息失宜，……猝倒无知也，曲池……足三里”，此外，亦有学者[9]总结近年来中西医手段治疗脑卒中的相关文献后发现曲池穴及足三里穴是使用频率最高的穴位，因此本研究选用曲池穴及足三里穴对MCAO大鼠进行干预具有理论可行性。在对各组大鼠神经行为学评分统计中我们发现经过MCAO造模后大鼠平很明显升高，这提示MCAO术使大鼠产生了明显神经缺损症状，经过针刺干预后大鼠神经行为学评分下降，提示针刺曲池穴及足三里穴可明显改善大鼠神经缺损症状，与此同时我们还发现模型组及针刺组大鼠脑片TTC染色后出现明显白色区域，这提示本研究造模是成功的，且经过针刺干预后大鼠脑梗死体积明显缩小，这提示电针能够减MCAO造模大鼠脑梗死体积，这一数据与国内外诸多文献结果一致。

研究中我们还发现MCAO术后大鼠神经元细胞排列错乱及皱缩，存在明显坏死现象，经过针刺干预后大鼠脑组织神经元细胞结构及形态有明显改善，这说明针刺曲池穴及足三里穴具有明显的脑保护作用。在进一步研究中我们对各组大鼠脑组织Notch信号通路上的标志性蛋白Notch1、Hes1进行检测，结果显示MCAO术后模型组及针刺组大鼠Notch1、Hes1的蛋白表达均降低，与空白组比较差异有统计学意义（P<0.05）。经过14 d干预后针刺组大鼠Notch1、Hes1的蛋白水平有所上调，与模型组比较差异有统计学意义（P<0.05）。Notch信号通路在机体中扮演信号装置的角色，相邻的神经元细胞通过Notch受体与相应配体结合，从而产生自我更新效应，亦有学者[10]认为Notch信号通路是决定神经元细胞增殖或凋亡的关键。Notch受体与配体结合后释放大量的活性物质，促进Notch 1因子出现核移位，与细胞核内的DNA相结合，由此激活其下游因子Hes家族，而Hes家族尤其是Hes1是调控神经干细胞增殖分化的重要因子，并可促进胶质生成而发挥神经元保护作用[11-15]，由此看来，针刺曲池穴及足三里穴发挥神经元保护效应的作用机制可能通过Notch信号通路进行介导。

本实验发现针刺曲池穴及足三里穴可明显改善MCAO大鼠神经缺损症状，通过激活Notch信号通路发挥脑保护作用，但本研究对MCAO大鼠进行为期14 d干预，大鼠具有极强的自愈能力，可能对本研究结果产生一定偏倚，下阶段将进行更严格的实验设计以期更为客观研究针刺的作用机制。

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