隔药饼灸对子宫内膜异位症大鼠过氧化物酶增殖体激活受体-γ和细胞间黏附分子-1表达的影响

周志刚 王晓洁 肖小文 王萍 覃肯

摘要 目的：觀察隔药饼灸对子宫内膜异位症大鼠过氧化物酶增殖体激活受体-γ（Peroxisome Proliferator-activated Receptor-γ，PPAR-γ）和细胞间黏附分子-1（ICAM-1）表达的影响。方法：选取34只大鼠，将其随机分为空白对照组（8只）和造模组（26只），采用改良的造模法建立子宫内膜异位症大鼠模型。将造模成功的24只大鼠随机分为模型组、隔药饼灸组和丹那唑组，每组8只。采用Western blot检测各组样本ICAM-1和PPAR-γ的表达。结果：与空白对照组比较，模型组、隔药饼灸组和丹那唑组大鼠的ICAM-1的表达显著上升（均P<0.05）。与模型组比较，隔药饼灸组和丹那唑组的ICAM-1的表达显著降低（均P<0.05）;与空白对照组比较，模型组、隔药饼灸组和丹那唑组PPAR-γ的表达显著降低（均P<0.05），与模型组比较，隔药饼灸组和丹那唑组的PPAR-γ的表达显著增强（均P<0.05）。结论：隔药饼灸能抑制ICAM-1表达，促进PPAR-γ的表达，从而抑制子宫内膜细胞的黏附，阻止血管生成。

关键词 子宫内膜异位症;隔药饼灸;细胞间黏附分子-1;过氧化物酶增殖体激活受体-γ;关元

Effects of Herb-partitioned Moxibustion on the Expression of ICAM-1 and PPARγ in Rats with Endometriosis

Zhou Zhigang1， Wang Xiaojie2， Xiao Xiaowen2， Wang Ping2， Qin Ken3

（1 Graduate College of Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine， Nanchang 330004， China; 2 School of Fundamental

Medicine of Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine， Nanchang 330004， China; 3 Medical Department

of Affiliated Hospital of Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine， Nanchang 330004， China）

Abstract Objective：To observe the effects of herb-partitioned moxibustion on the expression of ICAM-1 and PPARγ in rats with endometriosis. Methods：A total of 34 female rats were randomly divided into 8 rats as control group and 24 rats for model establishment group. The endometriosis model was established by modified methods. 24 model rats were randomly divided into the model group， the herb-partitioned moxibustion group and the Danazol group with 8 rats in each group. The expression of ICAM-1 and PPARγby was detected by western blotting method. Results：Compared with the control group， the expression of ICAM-1 in the model group， the herb-partitioned moxibustion group and the Danazol group was significantly increased （P<0.05）; compared with the model group， the expression of ICAM-1 in the herb-partitioned moxibustion group and danazol group was significantly decreased （P<0.05）; compared with the control group， the expression of PPARγ in the model group， herb-partitioned moxibustion group and Danazol group was significantly decreased （P<0.05）. Compared with the model group， the expression of PPARγ in the herb-partitioned moxibustion group and the Danazol group was significantly increased （P<0.05）. Conclusion：Herb-partitioned moxibustion can inhibit the expression of ICAM-1 and boost the expression of PPARγ， which can inhibit the adhesion of endometrial cells and prevent angiogenesis.

Key Words Endometriosis ; Herb-partitioned moxibustion; ICAM-1; PPARγ ; Guanyuan （RN 4）

中图分类号：R245;R711.3文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.03.038

子宫内膜异位症（Endometriosis，EMs）是指子宫内膜组织出现在子宫以外，临床常表现出痛经、性交痛，不孕等症状。其发病机制和原因尚不明确，但大多数学者认为其病理生理过程包括异位病灶的黏附、侵袭和血管形成[1]。严重影响到女性的正常生活[2]。研究显示，EMs在育龄女性中的流行率达15%，而50%的不育患者合并EMs，50%～60%各种盆腔疼痛的女性也合并有EMs[3]。临床治疗以手术和药物治疗为主，药物治疗存在着许多不良反应，而手术治疗切除病灶但仍可复发且增加组织黏连风险而导致卵巢功能受损甚至丧失[4]。灸法治疗EMs能有效地改善患者临床症状、防止复发、降低某些药物不良反应、促进妊娠，且其价格相对低廉，无明显毒性反应，作用时间持久[5]，适于长期使用等独特的优势[6]。这有利于降低生产力损失、生命损害和医疗保健的消费，从而降低患者和社会的医疗成本。但灸法治疗子宫内膜异位症的机制还有待于进一步阐明，本研究通过检测异位子宫内膜过氧化物酶增殖体激活受体-γ（Peroxisome Proliferator-activated Receptor-γ，PPAR-γ）和细胞间黏附分子-1（Inter-cellular Adhesion Molecule-1，ICAM-1）的表达来阐明隔药饼灸对异位子宫内膜的黏附和新生血管形成的影响。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物

购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司[动物许可证号SCXK（湘）2013-0004]的清洁级健康雌性未孕9周SD大鼠，体重（200±20）g。所有实验大鼠置于室温（25±2）℃环境下饲养，自由饮水和摄食。

1.1.2 药物

药饼[上海市针灸经络研究所制备（将木香、红花、肉桂、丹参、附子等切碎研磨，以黄酒调和）];达那唑胶囊（民生药业，国药准字H33022461）;直径5 mm细艾条（南阳汉医艾绒有限责任公司）;

1.1.3 试剂与仪器

磷酸酶抑制剂（碧云天生物技术研究所）、PMSF（碧云天生物科技研究所）、RIPA裂解液（碧云天生物科技研究所）、BCA蛋白浓度测定试剂盒（碧云天生物科技研究所）、蛋白maker（北京全氏金生物技术有限公司）、PVDF膜（Millipore）、β-actin抗体（武汉博士德生物工程有限公司）、检测抗体PPAR-γ和ICAM-1（武漢三鹰生物技术有限公司）、显影定影试剂盒（武汉巴菲尔生物技术有限公司）。微量移液器（Eppendorf），电泳仪电源（北京六一仪器厂，型号DYY-7C），垂直电泳槽（北京六一仪器厂，型号DYCZ-24DN），电转仪（北京六一仪器厂，型号DYCZ-40），水平摇床（江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司，型号TS-1），PH计（德国Metter-Toledo GmbH公司，型号LP115），CPA型号电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备

将34只清洁级雌性大鼠随机分为空白对照组（8只）和造模组（26只）。造模组给予5 d乙烯雌酚0.02 mg/kg灌胃，使大鼠处于动情期。参照自体移植造模方法进行造模[7]，造模7 d后随机挑选2只造模组大鼠给予断头处死并解剖显示病灶部位有5～8 mm的半透明囊肿，囊肿内充满液体并有血管形成，提示造模成功。

1.2.2 给药方法

将24只造模成功的大鼠分为模型组、隔药饼灸组和丹那唑组，每组8只。1）空白对照组：将大鼠放入自制固定器中，使其头部、四肢、尾部固定，暴露关元穴，固定器置于支架上，不做其他处理，7 d为1个疗程，共2个疗程，疗程间隔3 d。2）模型组：将大鼠放入自制固定器中，使其头部、四肢、尾部固定，暴露关元穴，固定器置于支架上，不做其他处理，7 d为1个疗程，共2个疗程，疗程间隔3 d。3）隔药饼灸组：大鼠固定后，在关元穴处涂医用凡士林少许，放置药饼（直径约0.5 cm），制小艾炷（绿豆大小，重量约15 mg），直接放在药饼上，用线香点燃，待艾炷燃至大鼠挣扎时用镊子夹去，每穴灸2壮，持续时间约10 min，7 d为1个疗程，共2个疗程，2个疗程中间隔3 d;4）丹那唑组：给予灌胃丹那唑混悬液（每天以36 mg/kg体重给药），1次/d，7 d为1个疗程，共2个疗程，2个疗程间隔3 d。

1.2.3 检测指标与方法

ICAM-1和PPAR-γ表达：用Western blot检测。取适量RIPA裂解液匀浆组织，根据蛋白分子量配制10%PAGE胶电泳，待测定蛋白浓度后，各样品取50 μg总蛋白上样电泳，判断目的蛋白得到充分分离（根据预染marker显示），取出marker切下的目的条带，用蒸馏水冲洗，将电转液中浸泡的与PAGE凝胶相同大小的PVDF膜取后浸泡在含5%脱脂奶粉的TBST（封闭液）中室温摇床封闭2 h。将PVDF膜浸泡在用封闭液稀释的相应一抗孵育液（1∶2 000稀释）4 ℃中过夜，用TBST充分洗涤PVDF膜后将PVDF膜浸泡于封闭液稀释相应的标记二抗孵育液（1∶50 000稀释），室温摇床孵育2 h。之后显色曝光。用BandScan分析胶片灰度值，用β-actin作为内参，计算出ICAM-1/β-actin和PPAR-γ/β-actin的值进行分析。

1.3 统计学方法

采用SPSS 16.0统计软件进行数据统计分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，各组间数据采用单因素方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ICAM-1检测结果 与空白对照组比较，模型组、隔药饼灸组、丹那唑组3组ICAM-1的表达量显著升高（均P<0.05）;与模型组组比较，隔药饼灸组、丹那唑组组中ICAM-1的表达量显著下降（均P<0.05）;与隔药饼灸组比较，丹那唑组的ICAM-1表达下降，差异无统计学意义（P>0.05）。

2.2 PPAR-γ检测结果 与空白对照组组比较，模型组、隔药饼灸组和丹那唑组PPAR-γ的表达量显著降低（均P<0.05）;与模型组组比较，隔药饼灸组、丹那唑组中PPAR-γ的表达量显著增强（均P<0.05）;与隔药饼灸组比较，丹那唑组的PPAR-γ表达量降低，但差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。

表1 4组ICAM-1/β-actin及PPAR-γ/β-actin的表达（±s）

注：与空白对照组比较，*P<0.05;与模型组比较，△P<0.05

3 讨论

子宫内膜异位症虽是良性疾病，但其病理特征具有恶性肿瘤的特性[8]。研究发现，子宫内膜在盆腹腔突破腹膜及器官“防线”，在“异域”生根、生长以至发病，要经过黏附（Attachment）、侵袭（Aggression）和血管形成（Angiogensis）等3个分子与病理变化过程，称之为“3A”模式[9];而内异症患者在位内膜的“3A”能力明显增强，其内膜逆流进入腹腔后，它们必须先和腹膜发生黏附，同时子宫内膜细胞之间也需要黏附、积聚成团，并且能突破机体的防御体系，才可能成功地种植生长[1]，导致疾病的发生。

实验研究表明，子宫内膜的异位生长需要细胞的黏附，在这个过程中细胞间黏附分子（Inter-cellular Adhesion Molecule-1，ICAM-1）发挥关键作用[10]。ICAM-1是单链糖蛋白的一种，为淋巴细胞功能相关抗原-1的配体，属于细胞黏附分子中的免疫球蛋白超级家族一员。研究发现，ICAM-1可介导细胞与细胞之间的黏附[11]，参与细胞信号转导、炎性反应等生理和病例过程[12]。有研究发现EMs异位内膜ICAM-1存在高表达，与疾病有密切的关系[13]。

过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（Peroxisome Proliferator-activated Receptor-γ，PPAR）属于Ⅱ型核受体超家族成员之一，PPAR-γ参与了机体多种生理病理过程，包括脂肪代谢、糖代谢、细胞增殖与分化、肿瘤发生、炎性反应及免疫反应等[14]。PPAR-γ通过与配体结合被激活产生炎性反应抑制反应、阻止血管生成等作用，这引起了广大科研学者的广泛关注，可能成为治疗子宫内膜异位症的新靶点。PPAR-γ在异位子宫内膜组织中表达情况的研究报道较少。Ohama等[15]研究表明PPAR-γ在体外培养的子宫内膜异位内膜基质细胞中有表达，而McKinnon等[16]发现PPAR-γ蛋白在人异位子宫内膜基质细胞和上皮细胞均呈高表达。Nenicu等[17]研究发现替米沙坦抑制小鼠异位子宫内膜异位组织生长除了通过阻断血管紧张素Ⅱ受体途径外，还与激活PPAR-γ途径有关。研究发现，PPAR-γ激动剂罗格列酮显著抑制狒狒腹膜异位子宫内膜组织的生长[18]，而且能显著抑制小鼠子宫内膜异位损伤部位体积[19]。由此推断PPAR-γ异位子宫内膜是非低表达，由上可知两者似有矛盾之处。

研究发现，灸法能抑制细胞ICAM-1的表达从而抑制细胞的黏附过程[20]，灸法可以激活细胞PPAR-γ的表达，有类似PPAR-γ激动剂作用[21]。我们前期研究发现，现代文献针灸治疗子宫内膜异位症主要取穴为关元、三阴交、气海、中极、子宫，经脉以任脉、足太阴脾经为主，主要分布在胸腹部，特定穴以募穴为主[22]，与中药组、西药组比，针灸治疗EMs的有效率及改善症状的疗效更佳，在VAS疼痛评分方面，针灸组相比对照组的治疗效果更具有优势[23]。在此研究基础上我们在关元穴上施隔药饼灸探讨其对子宫内膜异位症大鼠信号转导通路的影响，结果显示隔药饼灸可以调控p38MAPK信号通路，减少IL-4表达，促进IFN-表达，介导炎性反应，促进Th细胞向Th1分化，Th细胞动态平衡有恢复趋势。

子宫内膜异位症是西医学病名，在中医学中并无此病名，根据其临床症状属于月经不调、不孕、崩漏等范畴。灸法不仅能提高患者妊娠率，缓解症状，而且无不良反应且降低医疗成本[5]。关元穴为下腹部靠近胞宫的任脉穴位，具有行气止痛、活血化瘀的功效。有研究显示EMs的病机是瘀阻冲任，在EMs的针灸取穴均以任脉穴位作为主穴，通过调理冲任使机体气血阴阳平衡，而关元穴的频次最高[22]。调查表明任脉穴位的常用功效有健脾和胃、调腹、调经引产、壮肾利尿等17项，这些功能可归纳为两大类：一是治疗任脉循行部位的疾病;二是治气、补虚、散寒、清热。“调腹（散积）”的功效出现702次。附子饼由木香、红花、肉桂、丹参、附子等组成，具有疏肝理气、活血化瘀的功效[24]，研究显示活血化瘀中药能抑制异位子宫内膜的生长[25]，对子宫内膜异位症的治疗有显著疗效[26]。

本研究在前期研究结果基础上，探索隔药饼灸对EMs“3A”模式中黏附和血管形成病理过程中作用。本研究结果发现，模型组大鼠的ICAM-1表達显著上升，推断在子宫内膜症病理过程中，ICAM-1高表达，介导异位内膜细胞与细胞之间的黏附，参与细胞信号转导、炎性反应等生理和病理过程;经隔药饼灸处理后，异位内膜组织中的ICAM-1的表达下调，可以推断在关元穴实施隔药饼灸后，经过艾灸的生物和非生物效应激，可以抑制ICAM-1的表达，使病理过程向良好方向发展。目前国内尚无子宫内膜异位症PPAR-γ表达的报道，但有报道发现子宫内膜癌患者的子宫内膜PPAR-γ呈低表达，在高分化的肿瘤细胞中呈高表达[27]。本实验显示，与空白对照组比较，模型组大鼠子宫内膜PPAR-γ明显降低，经过隔药饼灸和丹那唑治疗后，子宫内膜PPAR-γ表达明显增强。本实验结果与McKinnon等[16]报道子宫内膜PPAR-γ高表达相反，但根据Nenicu等[17]抑制小鼠异位子宫内膜异位组织生长与激活PPAR-γ有关的报道，可以推断子宫内膜PPAR-γ表达至少是非低表达，因此本实验数据更符合实际。所以我们可以推测在关元穴实施隔药饼灸具有类似PPAR-γ激动剂作用，可以阻止新生血管形成。

由此可知，隔药饼灸可以抑制子宫内膜异位症大鼠ICAM-1和促进PPAR-γ的表达来抑制细胞与细胞之间的黏附作用和阻止新生血管形成。这为临床使用隔药饼灸治疗EMs提供了有力的理论指导。

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