补阳还五汤超微饮片对局灶性脑缺血大鼠神经干细胞移植后Bcl—2、Bax表达的影响

廖亮英 蔡光先 周赛男

〔摘要〕 目的 探討补阳还五汤超微饮片对局灶性脑缺血大鼠神经干细胞移植后凋亡相关基因Bcl-2、Bax的影响。方法 将SD大鼠80只，雌雄各半，复制局灶性脑缺血大鼠模型，造模后按神经功能缺损评分进行分层，随机分为5组，每组15只，分别于移植后7 d、14 d、28 d进行神经功能评分，采用补阳还五汤超微饮片与传统饮片予以干预，于相应时间点处死大鼠后采用免疫组化法检测凋亡基因Bcl-2、Bax。结果 补阳还五汤能显著减轻神经功能缺损，Bcl-2、Bax在各时间点（7 d、14 d、28 d）表达与模型组比较差异有统计学意义（P<0.05），模型加移植加补阳还五汤超微饮片组上调Bcl-2、拮抗Bax表达的作用优于模型加移植加补阳还五汤传统饮片组，差异有统计学意义（P<0.05）。结论 补阳还五汤可调节脑缺血后Bcl-2、Bax的表达， 是其促进神经功能恢复的可能机制之一，且超微饮片组的作用较传统饮片组更加显著。

〔关键词〕 补阳还五汤；局灶性脑缺血；神经干细胞；细胞移植；Bcl-2；Bax

〔中图分类号〕R289.3；R255.2 〔文献标志码〕A 〔文章编号〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2018.03.007

Effects of Buyang Huanwu Ultra-Fine Powder on Apoptosis Gene Bcl-2 and Bax of Transplanted Neural Stem Cells in Rats with Focal Cerebral Ischemia

LIAO Liangying1， CAI Guangxian2*， ZHOU Sainan2

（1. The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China；

2. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China）

〔Abstract〕 Objective To investigate the effects of Buyang Huanwu ultra-fine powder on apoptosis protein of Bcl-2 and Bax in transplanted neural stem cells in rats with focal cerebral ischemia. Methods Eighty Sprague-Dawley rats， half male and half female， were copyed the focal cerebral ischemia models， which were randomly divided into five groups， 15 rats in each group. The model rats were intervened by using Buyang Huanwu ultra-fine powder and traditional decoction. At 7 d， 14 d and 28 d of post-tansport， the neural function defect scale was measured. The rats were sacrified at according time. Bcl-2 and Bax were detected by immunohistochemical staining. Results Buyang Huanwu decoction could improve the neurological defect. Compared with model group， the expression of Bcl-2 and Bax increased obviously at different time points （7 d， 14 d， 28 d）， the differnces were statistically significant （P<0.05）. The model-transplantation-Buyang Huanwu ultra-fine powder group in increasing Bcl-2 and decreasing Bax was better than the model-transplantation-traditional Buyang Huanwu decoction， the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion Buyang Huanwu decoction could regulate the expression of Bcl-2 and Bax protein after cerebral ischemia， which may be one of mechnisms of promoting the recovery of neural function. The effect of Buyang Huanwu ultra-fine powder was better than traditional decoction.

〔Keywords〕 Buyang Huanwu decoction； cerebral ischemia； neural stem cell； cell transplantation； Bcl-2； Bax

缺血性脑血管病（ischemic cerebral vascular dis

ease，ICVD）以其高发病率、高致残率和高死亡率严重危害着人们的身体健康，已成为现代医学研究的热点问题[1]。补阳还五汤是中医治疗缺血性脑损伤的有效经典方，能够降低患者的致残率[2]。Bcl-2和Bax基因是细胞凋亡过程中重要的调节基因，研究表明脑缺血后神经功能恢复重建的机制可能与神经干细胞凋亡的相关调控基因密切相关，本试验拟探讨超微补阳还五汤对局灶性脑缺血大鼠神经干细胞移植后Bcl-2、Bax表达的影响及其作用特点，以更好地应用于临床。现报道如下。

1 材料

1.1 药物

补阳还五汤传统饮片：处方来源于《医林改错》，组成如下：黄芪120 g，赤芍10 g，川芎10 g，全当归10 g，干地龙10 g，红花10 g，桃仁10 g，药材购自我院药剂科，经鉴定均为道地药材，符合《药典》规定，一煎加水500 mL，煎汁150 mL，二煎加水300 mL，煎汁150 mL，两煎混合，文火煎成膏状（每mL含生药1.5 g），4 ℃冷藏备用。补阳还五汤超微饮片：取传统补阳还五汤剂量的1/3并混合，采用震动粉粹技术（用贝利粉碎机），将黄芪、赤芍、川芎、全当归、干地龙、红花粉碎至1～75微米，桃仁粉碎至200～400微米（40～80目），收集微粉，一煎加水500 mL，煎汁150 mL，二煎加水300 mL，煎汁150 mL，两煎混合，文火煎成膏状（每mL含生药0.5 g），4 ℃冷藏备用。

1.2 试剂

DMEM/F12粉由Hyclon公司提供；bFGF由R&D公司提供；B27添加物、EGF由GLBCO公司提供；胰酶、EDTA、Qtracker Cell Labeling Kit Protocol、 Rabbit Anti-Bcl-2抗体，产品批号：BA0412、Rabbit Anti-Bax抗体，产品批号：BA0315，均由武汉博士德生物工程公司提供；细胞凋亡检测试剂盒，产品批号：MK1022，由长沙丽欣生物公司提供；水合氯醛、0.01MPBS、Triton-X100、双氧水、甲醇、无水甘油由长沙丽欣生物公司提供；SABC试剂盒、AEC显色剂、多聚赖氨酸包埋玻片、水溶性封片剂由北京中杉生物公司提供。

1.3 动物

SD大鼠80只，清洁级，体质量（280±20） g，雌雄各半，由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供，动物合格证号：004535，实验动物生产许可证为SCXK（沪）2003-0002。

1.4 仪器与器械

BX-51光学显微镜、AlphaImager显微图像分析系统、IX71倒置显微镜、CCD摄像头（日本Olympus公司）；Galaxy 170R CO2培养箱（shell lab 公司）；WP8025鼠脑立体定位仪（美国WPI公司）；TDZS-WS台式离心机（湘仪）；Pureloab Classic UVF 超纯水仪（Millopor 公司）；E60冰冻切片机（英国shamton公司）；BFM-T6B2微粉机（济南贝利公司）。

2 方法与结果

2.1 方法

2.1.1 神经干细胞的分离、培养、传代 参考本研究团队建立的方法[3]从新生3～5 d SD大鼠脑内分离纯化。

2.1.2 模型制备 参考文献[3]采用大脑中动脉线栓法复制局灶性脑缺血大鼠模型，造模后有5只SD大鼠死亡。待动物清醒24 h后，参考文献[3]采用Zea Longa神经功能缺失评分标准初步评价动物造模情况。

2.1.3 细胞标记 参考文献[4]采用量子点的标记方法。

2.1.4 细胞移植 参考文献[5]采用侧脑室细胞移植的方法。

2.1.5 动物分组与给药 将造模后的SD大鼠按神经功能缺损评分进行分层，随机分为5组：模型组（A组）、模型+空白移植组（B组），模型+移植组（C组），模型+移植+补阳传统饮片组（4.57 g/kg，D组），模型+移植+补阳超微饮片组（1.52 g/kg，E组），每组各15只。动物手术后分别观察存活7、14和28 d，每组每个时间点各5只。各组分别灌胃给药，A组和B组给予等体积生理盐水，给药体积均为10 mL/kg，每天给药1次。

2.1.6 神经功能评价 参照文献[3]分别于处死前进行神经功能评分。

2.1.7 动物处理 动物注射细胞后分别存活7、14、28 d，参考文献[3]进行组织处理。

2.1.8 存活細胞检测 采用免疫组化法检测Bcl-2、Bax，严格按照试剂说明书完成，每只动物随机取海马部位切片5张，置于100倍物镜下，每张切片随机选3个视野，用 Olympus Micro Image 4.0图像处理系统自动计数免疫阳性细胞数。

2.1.9 统计学方法 所有数据应用SPSS 16.0统计软件进行处理，计量资料以“x±s”表示。多组间均数比较用方差分析，方差分析前先进行正态性、方差齐性检验，满足条件者用F检验，F检验有统计学意义者，再进行两两比较；两两比较方差齐者用SNK法，方差不齐者用Tamhane′s T2法。以P<0.05为差异有统计学意义。

2.2 结果

2.2.1 细胞标记情况 在神经干细胞液中加入量子点标记液后，绝大多数神经干细胞被标记，而且由其传代分化的细胞亦被标记。

2.2.2 补阳还五汤超微饮片对局灶性脑缺血大鼠神经干细胞移植后Bcl-2表达的影响 C组Bcl-2表达水平较A、B组增加，D、E组Bcl-2表达水平较C组增加，E组上调Bcl-2表达较D组明显，组间比较差异有统计学意义（P<0.05）。组内比较：三组在7、14、28 d Bcl-2表达差异有统计学意义（P<0.05）。见表1，图1-3。

2.2.3 补阳还五汤超微饮片对局灶性脑缺血大鼠神经干细胞移植后Bax表达的影响 C组Bax表达水平较A、B组增加，D、E组Bax表达水平较C组减少，说明D、E组均能下调Bax表达，E组下调Bax表达较D组明显，组间比较差异有统计学意义（P<0.05）。组内比较三组在7、14、28 d Bax表达差异有统计学意义（P<0.05）。见表2，图4-6。

3 讨论

缺血性脑血管疾病是目前严重危害人类生命健康的主要疾病之一，其高发病率和致残率使得对该病的研究成为热点。脑组织受损后，构成神经系统结构和功能的基本单位——神经元大量丢失导致脑功能缺失，而定向诱导可促进神经干细胞向神经元分化[6]，且神经干细胞在体外无限增殖，可促使神经受损后神经功能的恢复[7]，是治疗神经系统退行性病变或缺失疾病的有效途径之一。Bcl-2和Bax基因是细胞凋亡过程中重要的调节基因，Bcl-2和Bax可通过形成同源或异源二聚体来调节细胞凋亡，也可独立地调节细胞凋亡[8]。

补阳还五汤是治疗缺血性脑损伤的经典方，能够降低患者的致残率，提高生存质量[9]。本研究团队前期结果表明补阳还五汤能促进缺血后脑内神经干细胞增殖、迁移、分化[10]，可调节脑缺血后caveolin1、2的表达[11]，这可能是其促进缺血后神经功能恢复机制之一[12-13]。

本研究采用导师多年的研究成果补阳还五汤超微饮片进行观察，实验结果表明，补阳还五汤能促进神经功能恢复，脑缺血损伤神经干细胞移植后Bcl-2表达上调，Bax表达下调，其量效关系体现在脑缺血后模型加移植加补阳还五汤超微饮片1.52 g/kg对脑缺血后大鼠Bcl-2、Bax表达的影响作用优于模型加移植加补阳还五汤传统饮片4.57 g/kg；提示补阳还五汤超微饮片的临床用药剂量可采用其传统饮片临床等效剂量的1/3。

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