玉米细胞分裂素Zmrr3的克隆及RNAi载体的构建

齐璐璐 马庆

摘要 应用聚合酶链式反应技术从鲁原92自交系玉米基因组中扩增了Zmrr3基因的第5外显子特异性片段，并以测序过的目的片段构建了RNAi的载体pCAMBIA303+RNAi+2F，该载体还有潮霉素、卡那霉素、GUS等筛选基因。可以用于细胞分裂素调控叶序变化的分子机制研究。

关键词 细胞分裂素；小干涉RNA；表达载体的构建；玉米

中图分类号：Q78 文献标识码：A 文章编号：2095-3305（2018）03-003-03

DOI： 10.19383/j.cnki.nyzhyj.2018.03.002

Abstract The PCR technique was used to amplify the exonspecific segments of Zmrr3 gene from Luyuan 92 of maize genome， and the Expression Vector with RNAi expression pCAMBIA303+RNAi+2F was constructed with the sequence of the target fragment， which contains Hygromycin， kanamycin kanamycin and GUS slective gene. It can be used to study the relation between cytokinins and phyllotaxis of Maizet in molecular mechanism.

Key words Zmrr3 gene； Small interference RNA； Construction of expression vector； Maize

玉米是禾本科黍屬（Zea）中仅有的一个种（Mays）。国内关于对生玉米的性状具体研究早在1971年时就有过报道，调节植物生长的重要基因和内外环境可能是植物叶发育进过程中的两大重要因素。而在玉米对生叶序突变体的研究发现其内源细胞分裂素的水平升高是对生突变的重要特征，但是这个结果还不能清楚解释叶序排列是如何发生的。美国冷泉港实验室的研究报道认为在玉米中细胞分裂素调控基因Zmrr3发生转座导致了其叶序对生的形成。ABPH蛋白是细胞分裂素调控基因Zmrr3的表达产物，只要是通过植物内源细胞分裂素的诱导，在内源细胞分裂素的作用下其在玉米顶端分生组织的空间表达迅速改变，因此会造成叶原基排布的变化。为进一步了解在玉米叶原基分化类型转换的调控中外源细胞分裂素所起的作用，设计了对玉米胚添加不同浓度的细胞分裂素处理，最终互生玉米幼胚茎尖分生组织位点在较高浓度的外源细胞分裂素的处理下发生膨大，但并未改变成对生植株，这可能与可获得的玉米胚材料叶原基已经形成有关。

RNA干涉是指双链RNA在是指由短双链 RNA 诱导的同源 RNA 降解，从而导致靶基因的表达沉默，产生相应的功能表现型缺失的现象。Cioppa 等人为筛选烟草耐旱或抗病等优良性状，用烟草 mosaic 病毒导入了不同的遗传序列，进而系统地进行基因敲除来实现。Knutzon等向油菜中导入硬脂酸ACP脱饱和酶的反义基因，结果直接使得其种子硬脂酸含量由2%提高到40%且转基因植株生活力正常。在植物的遗传发育及作物的抗病及优良品种选育等领域，RNAi应用的比较广泛。因此，为验证细胞分裂素与玉米叶序类型之间的关系，该次试验设计构建了细胞分裂素调控基因Zmrr3RNAi载体，以期为进一步研究细胞分裂素与叶序类型转换之间的关系奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 作物材料 互生玉米自交系鲁源92叶片。

1.1.2 菌种及质粒 质粒转化受体菌DH5α、载体pCAMBIA1303安徽省作物生物学重点实验室提供；农杆菌 LBA4404，中科院等离子体物理研究所植物分子生物学实验室提供；质粒pUCCRNAi，中科院遗传所提供。

1.1.3 酶及试剂 MgCl2、PCR buffer、dNTPs、和Taq DNA聚合酶，购自上海生工生物工程有限公司；限制性内切酶和T4DNA连接酶，购自 Takara大连宝生物工程有限公司，PCR Marker DL2000和Genome DNA Markerλ＼HindⅢ，购自Takara公司；AS（乙酰丁香酮）、TrisHCl和RNase，购自Promega公司；DNA抽提纯化试剂盒，购自上海华舜生物工程有限公司；其他常用药品均为国产分析纯试剂。Takara大连宝生物工程有限公司完成PCR引物由合成，上海博亚生物工程公司完成测序服务。

1.2 细胞分裂素Zmrr3基因片段的PCR扩增

通过NCBI网站获取玉米细胞分裂素调控基因Zmrr3的全长基因序列和cDNA序列。运用clustal W软件对以上序列进行同源性搜索和比对分析，确定目的基因片段序列为玉米Zmrr3基因的第5个外显子特异序列共86 bp。分别在正、反向上游引物的5分别添加了BamHⅠ。正向下游、引物的5分别添加了NcoⅠ和XbaⅠ位点，反向下游引物的5添加了XbaⅠ位点，采用手工设计，并利用引物设计程序进行辅助分析。（目的片段加酶切位点和保护碱基后的总大小如下， 正向片段109 bp； 反向片段103 bp）

正、反向上游引物：5ATAGGATCCGCGGCAAGTAGTAGCACAGC3

正向下游引物：5CCTCTAGACCATGGAATGCCGCTGCTACAGCTAC3

反向下游引物：5CCTCTAGAAATGCCGCTGCTACAGCTAC3

划线部分为酶切位点，其评估与优化工作由Primer Design程序完成。

通过Biometra96梯度PCR仪扩增，PCR扩增反应体系（50 μl）：ddH2O，37.6 μl；3primer（10 μmol/L），2 μl；5primer（10 μmol/L），2 μl；dNTP（10 mmol/L），1 μl；10×PCR buffer（包括MgCl2）， 5 μl； Template（50 ng/μl），2 μl；Taq DNA polymerase（5 U/μl），0.4 μl。

PCR优化反应条件为：94℃预变性5 min，94℃变性1 min，62.5℃退火1 min，72℃延伸1 min，35个循环，72℃延伸10 min。

扩增后的产物在含有0.5 μg/ml溴化乙锭的3%琼脂糖凝胶上电泳，电压为5 V/cm，电泳结果由Kodark凝胶成像系统拍照记录分析。

1.3 PCR产物的克隆、筛选和序列分析

PCR产物电泳回收后，与pMD18T vector以3∶1的比例，加Ligation Solution I 4.0 ml混匀，l6℃反应过夜，将连接产物转化大肠杆菌DH5α。挑选白斑用碱裂解法提取质粒，限制性内切酶酶切鉴定，得到重组质粒，其中插入的目的基因，测序完成后用DNASIS软件进行核酸序列分析。

1.4 siRNA表达载体的建立

将pUCCRNAi质粒和PCR产物分别用XbaⅠ、BamHⅠ双酶切，酶切反应体系为20 μl，具体为：pUCCRNAi或纯化的PCR片段1 μl，10×bufferM 8 μl，XbaⅠ1 μl，1%BSA 0.1μl，電动混匀，37℃保温6 h，60℃灭活15 min。再加入ddH2O 7 μl，10×bufferK 2 μl，BamHⅠ 1 μl，电动混匀，30℃保温3 h，60℃灭活15 min，于4℃冰箱保存备用。将酶切后的载体与扩增产物在1.4%琼脂糖凝胶上电泳，并且将胶纯化回收的片段置于16℃连接过夜，连接反应体系如表1所示。

将PCR扩增的目的基因片段和pUCCRNAi质粒分别用BamHⅠ、XbaⅠ酶切、连接，得重组质粒pUCRNAi+1F，并酶切验证；对重组质粒pUCRNAi+1F进行BglⅡ、SpeⅠ双酶切，再与用BamHⅠ、NcoⅠ双酶切的目的片段连接，从而构建成含有正反目的片段的pUCRNAi+2F载体，酶切验证同上。然后对pUCRNAi+2F载体进行SpeⅠ与NcoⅠ双酶切，回收目的片段，然后与经过SpeⅠ与NcoⅠ双酶切双酶切的pCAMBIA1303载体进行连接，构建成pCAMBIA1303+RNAi+2F载体如图1所示。

2 结果与分析

2.1 目的基因片段的获得

采用CTAB法提取自交系鲁原92玉米叶片基因组，通过0.8%琼脂糖凝胶电泳和紫外检测如图2所示，表明提取的玉米基因组主带清晰，OD260/OD280均在1.8～2.0之间，符合试验要求。

2.2 细胞分裂素Zmrr3基因片段扩增

使用引物1和2扩增Zmrr3基因的第5个外显子片段， 并通过于3.0%琼脂糖凝胶电泳，结果如图3所示，分别得到与预期目的片段大小一致的单一扩增带。pMD18T载体与扩增目的条带回收后连接并转化大肠杆菌DH5α。筛选出阳性克隆，经酶切分析，分别得到103 bp和109 bp大小的2条片段。说明按预期设计，该目的基因插入到载体上。并通过测序验证了其正、反序列与已发表的基因一致。

2.3 pCAMBIA1303+RNAi+2F载体的构建

Zmrr3基因PCR扩增的109 bp的正向片段和pUCCRNAi质粒分别用XbaⅠ、BamHⅠ酶切、连接，筛选重组质粒pUCRNAi+1F，并通过PstⅠ酶切鉴定，得到一条约362 bp特异带，证明109 bp的干涉片段已经正向连接在pUCCRNAi载体上。对重组质粒pUCRNAi+1F进行BglⅡ、 SpeⅠ双酶切，然后与NcoⅠ、 BamHⅠ双酶切的103 bp的反向目的片段连接，PstⅠ酶切验证重组质粒pUCRNAi+2F，得到465bp的特异带，表明反向干涉片段已反接到pUCCRNAi载体上，如图4所示。

对SpeⅠ、NcoⅠ双酶切后的pUCRNAi+2F载体和pCAMBIA1303载体连接，构建成pCAMBIA1303+RNAi+2F载体。并通过酶切（XhoⅠ）验证构建pCAMBIA1303+RNAi+2F载体，得到1 094 bp特异带如图5所示。表明pUCRNAi+2F片段已连接到pCAMBIA1303载体上，从而方便以后将目的片段通过农杆菌介导转入玉米优良自交系。

3 结论与讨论

RNA干涉技术发展迅速，已广泛应用于动植物的相关基因的功能研究。如果后续Zmrr3干涉的载体转化能够达到预期结果，即可以直观地观察到叶序的变化时，那么也可以考虑将载体中的正反干涉片段作为一种筛选标记基因整合到欲转化的载体上，通过转化过程中抑制细胞分裂素调控基因的表达导致叶序的转变来起到筛选的作用。其优点表现为以下2点：①筛选方便，可直接根据观测到的叶序类型的变化来判断是否转入到受体植株中；②安全，高效。普遍使用的常规抗生素筛选标记，如氨卞青霉素、卡那霉素、潮霉素等，其在筛选过程中均会造成不少转基因植株的死亡，从而在不同程度上影响了转基因的效率。而若使用干涉片段作为筛选标记时，该环节的损失相对有所减少，提高了转基因的效率。

此外，椐报道RNAi介导的基因沉默可能受环境的影响，基因沉默可能收到温度方面的影响。温度越低，基因沉默越易受到抑制， siRNAs 同时也会随之降低；反之，温度越高， 基因沉默越容易被激活，且siRNAs也随之增加。所以在后续的载体保存和转化中还应注意试验温度的影响。

有研究报道有些植物对卡那霉素不敏感，玉米也是其中之一，但很多文献报道玉米、小麦等对潮霉素较敏感，因此潮霉素是玉米等作物转基因植株较理想的筛选标记。该次试验中构建的细胞分裂素Zmrr3干涉的表达载体中含有潮霉素抗性基因，并且还含有GUS检测基因，利用GUS作为报告基因，为后续转化体的瞬时检测提供了方便。

参考文献

[1] Li LY， Yan CQ， Zhang MC，et al. Study Progress in Oppositifolious Maize[J]. Journal of Maize Sciences， 2004，12：21-25.

[2] 马庆，齐璐璐，李晓玉，等.对生和互生玉米内源激素含量的差异分析[J].农业生物技术学报，2008，16（6）：995-1000.

[3] A GIULINI， J WANG， D JACKSON. Control of phyllotaxy by the cytokinininducible response regulator homologue ABPHYL1[J].Nature， 2004， 430（7003）： 1031-1034.

[4] 井长勤，张秀华，刘涌涛.RNA干涉技术研究进展[J].安徽农业科学，2007，35（13）：3780-3781，3794.

[5] 项艳，朱苏文，程备久.RNA干涉技术（RNAi）应用研究进展[J].激光生物学报，2003，12（6）： 460-462.

[6] 王彦霞，刘正杰，马峙英，等. RNA干涉技术干涉技术与棉花高油育种[J].棉花学报，2011， 32（2）：178-183.

责任编辑：刘赟