黑曲霉缺失突变体菌株ΔsodC的构建

付松

摘要 为探究黑曲霉中的超氧化物歧化酶编码基因sodC在其抗氧化代谢方面所起的作用，构建得到黑曲霉缺失突变体菌株ΔsodC。根据同源重组的技术原理，以黑曲霉基因组DNA为模板，扩增获得目的基因sodC的上下游侧翼片段，利用重叠序列对上下游片段进行PCR连接。将该片段与质粒pC3进行连接，并将其转入DH5α感受态细胞，通过蓝白斑筛选及PCR鉴定，得到已构建成功的重组质粒。通过CaCl2/PEG转化法将重组质粒转入黑曲霉原生质体。通过多步骤的筛选及基因组DNA序列的检测，得到所需突变体菌株ΔsodC以备后续研究使用。

关键词 黑曲霉；缺失突变体；超氧化物歧化酶；同源重组

中图分类号：Q933 文献标识码：A 文章编号：2095-3305（2018）03-001-02

DOI： 10.19383/j.cnki.nyzhyj.2018.03.001

Abstract In order to investigate the role in terms of the gene sodC in the antioxidant metabolism in Aspergillus niger，the deletion mutant ΔsodC was constructed. According to the principal of homologous recombination，the upstream and downstream flanking fragments of the gene sodC were amplified by using the genomic DNA of Aspergillus niger as template. Then the upstream and downstream flanking fragments were connected with PCR by using overlapping sequences. The fragment ABCD was connected with plasmid pC3 and transferred into the DH5α competent cells. The recombinant plasmid pC3ABCD was constructed successfully by blue spot screening and PCR identification. The recombinant plasmid was transferred into protoplast of Aspergillus niger by CaCl2/PEG transformation method. Through multistep screening and the detection of genomic DNA sequences，we could get the deletion mutant ΔsodC，which could be used for the future research.

Key words Aspergillus niger； Deletion mutant； Superoxide dismutase； Homologous recombination

黑曲霉（Aspergillus niger），曲霉屬真菌中的一个常见种。它广泛分布于土壤和植物性产物中，既是重要的工业发酵菌种，但同时也是一种能导致粮食霉变的致病真菌。从20世纪90年代开始，分子生物学的进步拉开了研究黑曲霉的序幕[1]。一些针对真菌的分子生物学操作手段如敲除载体、转化法、筛选标记等被用到了黑曲霉中[2]。这些工作都为更好地研究黑曲霉的基因功能奠定了基础。

超氧化物歧化酶（SOD，superoxide dismutase，EC 1.15.1.1）是一种重要的抗氧化金属酶类。生物体中主要有3种SOD类型，根据所含离子的不同，分为Cu/ZnSOD，FeSOD和 MnSOD。真核生物含有位于线粒体的MnSOD和位于细胞质的Cu/ZnSOD。Cu/ZnSOD是真核细胞细胞质中常见的一种超氧化物歧化酶，它由2个亚基组成，每个亚基分别含有1个铜离子和1个锌离子[3]。已知在酿酒酵母和白色念珠菌中，Cu/ZnSOD （SOD1，也被叫作CCS1） 在抵抗氧化胁迫方面具有重要的作用[4]。但是黑曲霉中基因sodC在氧化胁迫条件下所起的作用尚不清楚。

丝状真菌的遗传学研究常存在多种问题，如同源重组率较低，筛选标记的选择等。此外，丝状真菌由于具有复杂的细胞壁结构等，外源基因进入并整合到染色体上的频率并不高[5]。提高转化效率是丝状真菌基因工程研究中亟待解决的问题。笔者利用CaCl2/PEG介导的原生质体转化法[6-7]，成功构建了黑曲霉突变体菌株ΔsodC。

1 材料与方法

1.1 菌株、质粒和培养条件

试验所使用的黑曲霉Aspergillus niger MA70.15（ΔkusA，pyrG-）和质粒 pC3（pyrG+）由安徽丰原生物化学股份有限公司实验室提供。黑曲霉生长在28℃葡萄糖土豆琼脂培养基（PDAUri）上或PDA液体培养基上，含200 g/L土豆，20 g琼脂，20 g葡萄糖和10 mmol/L尿苷。

1.2 黑曲霉sodC基因敲除载体的构建

首先从黑曲霉基因组数据库中获取sodC基因序列，然后再选取基因sodC上下游1 500 bp左右的片段，并进行酶切位点及保护碱基的添加来设计合适的2对引物A、B和C、D。引物序列见表1。

参照“MasterPure Yeast DNA Purification Kit”使用说明，提取黑曲霉MA70.15菌株的基因组DNA。以黑曲霉基因组DNA为模板，利用2对引物A、B和C、D，扩增获得sodC目的基因的上下游侧翼片段AB和CD。利用重叠序列对上下游片段进行PCR连接，得片段ABCD。将该ABCD片段与质粒pC3进行连接，得重组质粒pC3ABCD，并将其转入DH5α感受态细胞，通过蓝白斑筛选及双酶切鉴定，得到正确的基因敲除载体pC3ABCD。

1.3 黑曲霉原生質体制备及聚乙二醇转化

制备黑曲霉原生质体，并参考Ballance等的方法，对原生质体进行聚乙二醇（PEG）介导的转化[8-9]。首先将黑曲霉MA70.15菌株接种到PDAUri固体培养基上培养（28℃恒温培养4 d），将所得孢子接种到PDAUri液体培养基中（20 ml），30℃，150 r/min，振荡培养过夜，收集并清洗培养物。室温下离心（3 000 r/min，5 min），收集孢子。用无菌的0.7 mol/L NaCl溶液（3 ml）重悬孢子，室温下离心（3 000 r/min，5 min），弃上清，避免去除沉淀。反复3次，达到清洗菌体的目的。随后在100 ml无菌锥形瓶中加入10 ml溶壁酶溶液及7 ml孢子悬浮液（107个/ml），37℃，70 r/min，对孢子细胞壁进行裂解3 h。每1.5 h用显微镜对孢子裂解情况进行观察。至孢子裂解为原生质体后，用无菌的4层擦镜纸对其进行过滤，得滤液，对其进行离心（4℃，20 000 r/min，10 min），小心去上清，留沉淀。用3 ml山梨醇TrisHCl（STC）溶液洗涤，离心（4℃，3 000 r/min，5 min）。后用700 ml STC重悬，轻柔吹吸，置于冰中待用。原生质体转化：200 μl原生质体（106个/ml），加20 μl重组质粒pC3ABCD和50 μl PEG转化缓冲液于10 ml离心管，温和混匀，冰浴20 min。

再加1 ml PEG转化缓冲液，温和混匀，室温下静止5 min，再加2 ml STC，温和混匀。将所得混合液体，直接倒入上层筛选培养基中，混匀，倒入2个下层筛选培养基中。待凝固后，将其放在恒温培养箱，28℃，倒置培养。

1.4 黑曲霉sodC缺失体的筛选及鉴定

参照 Delmas 等的方法，进行后续筛选。挑取上一步中已长出的黑曲霉单克隆的孢子（含质粒 pC3ABCD），经过2次MM固体培养基的培养（28℃恒温培养4 d），进行纯化。后将所得孢子接种到PDAUri固体培养基上（28℃恒温培养4 d），经2次培养。将上一步培养所得的孢子涂布到MMUri5FOA（1%葡萄糖，1.6 mmol/L尿苷，750 μg/ml 5-氟-乳清酸）固体培养基中，28℃恒温培养3 d。将所得的孢子用MMUri5FOA液体培养基进行培养（28℃，250 r/min，摇床振荡培养3 d）。最后，提取黑曲霉菌丝体的基因组DNA对其基因序列进行检测。

2 结果与分析

2.1 sodC侧翼片段AB、CD和ABCD的PCR合成及纯化

以黑曲霉MA70.15基因组DNA为模板，进行PCR扩增（图1），所得产物大小分别为上游片段AB 902 bp，下游片段CD 520 bp，与理论值相符。对片段AB、CD分别进行切胶纯化，得纯化后的片段AB和CD，大小与理论值相符。后进行片段AB和CD的PCR连接，所得产物片段ABCD及纯化后的片段均约为1 400 bp（图1）。

2.2 sodC侧翼片段ABCD和pC3质粒的连接及鉴定

将sodC侧翼片段ABCD进行EcoR I/Xho I双酶切，纯化后的片段与双酶切后的pC3载体进行连接。对所得到的pC3ABCD质粒分别进行PCR鉴定及EcoR I/Xho I双酶切鉴定。由图2可见，所得PCR鉴定产物大小约为1 400 bp，与理论值相符。质粒pC3产物大小约为5 850 bp，与理论值相符。对重组质粒pC3ABCD进行双酶切，发现产物有2条带，上方的为pC3载体，大小约为5 850 bp；下方的条带为片段ABCD，大小约为1 400 bp，大小与理论值相符。说明sodC基因敲除载体pC3ABCD已构建成功。

2.3 黑曲霉sodC缺失体的鉴定

重组质粒pC3ABCD被转入到黑曲霉原生质体内，经过多重筛选，得转化株。后提取野生型及转化株的基因组DNA对其基因序列进行检测，结果显示所得突变体菌株ΔsodC中的基因sodC确已敲除。

3 结论

试验基于重组质粒与染色体同源重组原理，对丝状真菌黑曲霉进行基因敲除。在此，使用的母本菌株为黑曲霉Aspergillus niger MA70.15（ΔkusA，pyrG-）菌株。其中pyrG基因，编码5氟乳清酸脱羧酶，作为一种双向筛选标记基因[10]，可以重复使用这一标记，最终使基因组中去除该标记基因[11]。事实上，缺乏这种酶的细胞不能在没有尿苷或尿嘧啶的条件下生长，但这些细胞可以抵抗5氟乳清酸的毒性。此外，所缺失的kusA基因（编码 Ku70 的同源蛋白），它的缺失不影响黑曲霉的生长，却能大大降低非同源末端连接的效率并提高同源重组率[12]。这两点正是此次构建突变体的关键所在。

参考文献

[1] BAKER S E. Aspergillus niger genomics：past，present and into the future [J]. Medical Mycology，2006，44（Suppl 1）：S17-S21.

[2] DELMAS S， LLANOS A， PARROU J L. Development of an unmarked gene deletion system for the filamentous fungi Aspergillus niger and Talaromyces versatilis [J]. Applied & Environmental Microbiology，2014，80（11）：3484-3487.

[3] LIN C T，LIN M T， CHEN Y T. Subunit interaction enhances enzyme activity and stability of sweet potato cytosolic Cu/Znsuperoxide dismutase purified by a Histagged recombinant protein method [J]. Plant Molecular Biology，1995，28（2）：303-311.

[4] GLEASON J E， LI C X， ODEH H M. Speciesspecific activation of Cu/Zn SOD by its CCS copper chaperone in the pathogenic yeast Candida albicans [J]. JBIC Journal of Biological Inorganic Chemistry，2014，19（4-5）：595-603.

[5] 许杨，涂追. 丝状真菌基因敲除技术研究进展[J]. 食品与生物技术学报，2007，26（1）：120-126.

[6] SHARON A. Molecular and cell biology methods for fungi [M]. Molecular and Cell Biology of Human Diseases，2010.

[7] 孙晶.黑曲霉基因缺失菌株的构建及其功能分析[D].哈尔滨：东北农业大学，2004.

[8] WERNARS K， GOOSEN T， SWART K. Genetic analysis of Aspergillus nidulans AmdS+ transformants [J]. Molecular Genetics and Genomics，1986，205（2）：312-317.

[9] BALLANCE D J， TURNER G. Development of a highfrequency transforming vector for Aspergillus nidulans [J]. Gene，1985，36（3）：321-331.

[10] BOEKE J D，LACROUTE F， FINK G R. A positive selection for mutants lacking orotidine5phosphate decarboxylase activity in yeast：5fluoroorotic acid resistance[J]. Molecular Genetics and Genomics，1984，197（2）：345-346.

[11] KHANG C H，PARK S Y，LEE Y H. A dual selection based，targeted gene replacement tool for Magnaporthe grisea and Fusarium oxysporum [J]. Fungal Genetics & Biology，2005，42（6）：483-492.

[12] MEYER V，ARENTSHORST M，ELGHEZAL A. Highly efficient gene targeting in the Aspergillus niger kusA mutant [J]. Journal of Biotechnology，2007，128（4）：770-775.

責任编辑：郑丹丹