甘蔗应答黑穗病菌侵染相关酶活性和内源激素含量的变化

宋奇琦 王露蓉 农友业 杨丽涛 李杨瑞

摘要：【目的】研究不同甘蔗品種与黑穗病菌长期互作过程中相关酶活性及内源激素含量的变化，为甘蔗应答黑穗病菌侵染的抗性机制提供理论依据。【方法】选用抗黑穗病品种桂糖29号和感黑穗病品种崖城71-374，用浸渍法接种黑穗病菌，对照组用无菌水模拟接菌。在接菌后30、60、90和180 d取甘蔗+1位叶为样品，分析几丁质酶、β-1，3-葡聚糖酶和过氧化氢酶（CAT）活性及生长素（IAA）、细胞分裂素（CTK）和乙烯（ETH）含量的变化。【结果】在整个侵染期间，两个甘蔗品种叶片的几丁质酶活性、β-1，3-葡聚糖酶活性及IAA、CTK含量呈逐步降低或波动下降趋势，均在接种后180 d达最低值，而CAT活性整体上呈上升趋势，在接种后180 d达最高值；其中抗性品种桂糖29号的β-1，3-葡聚糖酶活性和ETH含量在整个浸染过程均高于感病品种崖城71-374。【结论】甘蔗在不同时期应答黑穗病菌胁迫的生理生化反应不同，感病品种与抗病品种的防御机制可能存在差异。

关键词： 甘蔗；黑穗病菌；酶活性；内源激素

中图分类号： S435.661 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）04-0650-06

Changes of related enzyme activity and endogenous hormone content in sugarcane response to smut fungus infection

SONG Qi-qi1， Pratiksha Singh1， Rajesh Kumar Singh1， WANG Lu-rong1，

NONG You-ye1， YANG Li-tao1，2*， LI Yang-rui1，2*

（1College of Agriculture， Guangxi University/State Key Laboratory for Conservation and Utilization Subtropical Agro-bioresources， Nanning 530004， China；2Sugarcane Research Center， Chinese Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Sugarcane Biotechnology and Genetic Improvement， Ministry of Agriculture/Guangxi Key Laboratory of Sugarcane Genetic Improvement，Nanning 530007， China）

Abstract：【Objective】The changes of related enzyme activities and endogenous hormone contents in different sugarcane varieties during the long term interaction with smut fungus were studied to provide theoretical basis to illustrate the resistance mechanism of sugarcane to smut fungus infection. 【Method】The smut-resistant variety GT29 and the smut-susceptible variety Yacheng 71-3744 were selected to be inoculated with smut fungus by dipping method； the control group was treated with sterile water to conduct simulated inoculation with fungus. Sugarcane +1 leaf samples were taken at 30， 60， 90 and 180 d respectively after the inoculation treatment， the changes of chitinase，β-1，3-glucanase and catalase（CAT） activities， and auxin（IAA）， cytokinin（CTK） and ethylene（ETH） contents were analyzed. 【Result】During the entire infection period， activities of chitinase and β-1，3-glucanase and contents of IAA and CTK the two sugarcane varie-ties leaves showed the trends of gradual decrease or fluctuating decrease， and they reached the lowest level 180 d after ino-culation. But the activity of CAT showed an increasing trend and reached the highest level 180 d after inoculation. β-1，3-glucanase activity and ETH content in the smut-resistant variety GT29 were always higher than those in the smut-susceptible variety Yacheng 71-3744 during the whole infection period. 【Conclusion】Physiological and biochemical responses of sugarcane to smut fungus stress are different at different growth stages，which may reflect different defense mechanisms between the susceptible variety and the resistant variety.

Key words：sugarcane； smut fungus； enzyme activity； endogenous hormone

0 引言

【研究意义】甘蔗是重要的生物能源作物，种植在包括中国在内的90多个国家。在甘蔗种植区，黑穗病已成为全球性的重要疾病，且患病率逐年提高。黑穗病感染严重时，可造成甘蔗生产20%～50%的损失（Martinez et al.，2000），但目前人们对甘蔗黑穗病菌的作用机制仍知之甚少。已有研究证明，一些酶活性和激素与植物抵御病害的能力密切相关（顾丽红等，2008；莫凤连等，2012）。因此，研究甘蔗感染黑穗病后酶活性和激素的变化可为揭示甘蔗与病原菌互作机制提供依据，同时为甘蔗抗性育种提供参考。【前人研究进展】几丁质酶、β-1，3-葡聚糖酶、过氧化氢酶（CAT）均为植物抗真菌病害的相关酶。目前，已将外源几丁质酶基因导入烟草（Broglie et al.，1991）、油菜（蓝海燕等，2000）、马铃薯（周思军等，2000）、西瓜（王果萍等，2003）和水稻（袁红旭等，2009）等植物中，发现其可有效提高植株的抗病能力。顾丽红等（2008）将几丁质酶基因及β-1，3-葡聚糖酶基因同时导入甘蔗品种ROC10和ROC22中，所得植株的抗黑穗病能力有不同程度增加。莫凤莲等（2012）通过研究甘蔗接种黑穗病菌后内源激素含量变化，发现甘蔗叶片中生长素（IAA）、赤霉素（GA）、脱落酸（ABA）、水杨酸（SA）含量及IAA/ABA的变化与甘蔗抗性密切相关。苏亚春（2014）研究发现，甘蔗抗性品种崖城05-179在感黑穗病初期的几丁质酶、β-1，3-葡聚糖酶和CAT活性均高于感病品种柳城03-182，可能这些酶活性与甘蔗黑穗病抗性有一定联系。王彦芹等（2017）利用RAN-Seq研究海岛棉应答黄萎病时与激素代谢相关差异基因表达，发现大多基因表达产生变化。【本研究切入点】酶和激素各具作用和特点，二者在合成和分泌上相互影响，共同调控机体抗性。目前针对甘蔗黑穗病的试验大部分在感病初期，通过甘蔗与病原菌的长期互作来探讨其应答机制的研究较少。【拟解决的关键问题】测定不同抗性品种甘蔗在不同时期的相关酶活性和激素含量变化，并比较分析其差异，为探讨甘蔗对黑穗病的抗性机制及甘蔗抗黑穗病育种提供理论依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

供试材料选用甘蔗品种桂糖29（GT29）和崖城71-374（Yacheng 71-374），由广西农业科学院甘蔗研究所提供。其中，GT29经历年试验调查观察，发现其新植和宿根均表现为高抗黑穗病（张荣华等，2011）；Yacheng 71-374经鉴定为高感黑穗病品种（高轶静等，2013）。黑穗病孢子收集于品种ROC22。

1. 2 试验方法

于2016年4～11月在广西大学甘蔗智能温室大棚进行试验。将蔗种砍成单芽段，水浴锅中50 ℃浸种2 h后进行沙培育苗。育苗1个月后，每个品种分别挑选60株长势一致的幼苗，用无菌水清洗后分成两组。一组幼苗在黑穗病孢子浓度为5×106/mL悬浮液中浸泡2 h作为处理组，另一组幼苗用无菌水浸泡2 h作为对照组。将幼苗移栽至直径36.3 cm、内高30.0 cm的塑料桶中，置于广西大学甘蔗智能温室内，分别在接菌后30、60、90和180 d分别取+1叶作为样品。采集的样品用蒸馏水清洗后擦干，去中脉，液氮冷冻，于-80 ℃保存备用。

1. 3 PCR检测

使用植物DNA提取试剂盒（北京康为世纪生物科技有限公司）从GT29和Yacheng 71-374感病及对照植株中提取基因组DNA；通过HP Fungal DNA Kit试剂盒（Omega Bio-Tek）提取黑穗病冬孢子DNA作为阳性对照，无菌水为阴性对照。用黑穗病菌检测引物bE4（5'-CGCTCTGGTTCATCAACG-3'）和bE8（5'-TGCTGTCGATGGAAGGTGT-3'）检测甘蔗是否感染黑穗病菌。引物bE4/bE8能扩增出黑穗病菌基因组序列上的一段特异序列，长度为459 bp（Albert and Schenck，1996）。PCR产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行凝胶纯化、克隆和测序。

1. 4 测定项目及方法

样品采集后，分别进行几丁质酶、β-1，3-葡聚糖酶和CAT活性及内源激素IAA、细胞分裂素（CTK）和乙烯（ETH）含量测定。酶活性和激素含量均使用植物酶聯免疫吸附剂测定（ELISA）试剂盒（武汉基因美生物科技有限公司）进行测定。所有试验均重复3次。

1. 5 统计分析

使用Excel 2007对试验数据进行整理。

2 结果与分析

2. 1 PCR检测结果

琼脂糖凝胶电泳检测结果（图1）表明，GT29和Yacheng 71-374接种黑穗病的植株与阳性对照均可扩增出459 bp左右的条带，对照植株则无此条带。PCR扩增的目的基因片段序列与GenBank中公布的bEast交配型基因序列相同，证实处理组甘蔗已感染黑穗病菌（GenBank登录号为KY575283-KY575284）。

2. 2 与黑穗病菌长期互作中甘蔗抗性相关酶活性的变化

2. 2. 1 几丁质酶活性变化 由图2可看出，抗性品种GT29在接种黑穗病菌后30 d时的几丁质酶活性高于对照且此时活性最高，为193.26 U/gFW，接菌后60 d几丁质酶活性降至39.41 U/gFW，90 d 时为37.35 U/gFW，180 d时降至-205.94 U/gFW。感病品种Yacheng 71-374的表现与GT29相似，在接种黑穗病菌后30 d几丁质酶活性最高（565.06 U/gFW），此后几丁质酶活性逐步降低，接菌后180 d降至最低值（-450.23 U/gFW）。可见，接种黑穗病菌后，两个甘蔗品种叶片的几丁质酶活性呈逐步降低趋势，以感病品种的酶活性下降幅度相对较大。

2. 2. 2 β-1，3-葡聚糖酶活性变化 由图3可看出，抗性品种GT29在接种黑穗病菌后30、60和90 d的β- 1，3-葡聚糖酶活性均高于对照，在接菌后180 d时β- 1，3-葡聚糖酶活性骤降至-913.91 U/gFW。与对照相比，感病品种Yacheng 71-374的β-1，3-葡聚糖酶活性在接菌后30、60和90 d呈现“升—降—升”的变化趋势，在接菌后180 d降至-1053.24 U/gFW。接菌后30～180 d，抗病品种GT29的β-1，3-葡聚糖酶活性均高于感病品种Yacheng 71-374。

2. 2. 3 CAT活性變化 如图4所示，在接种黑穗病菌后的30、60、90和180 d，与对照相比，抗性甘蔗品种GT29的CAT活性呈“降—降—降—升”的变化趋势，感病品种Yacheng 71-374的CAT活性呈“降— 降—升—升”的变化趋势，二者均在接菌后180 d CAT活性达最高值，分别为10.86和41.16 U/gFW。两个品种CAT活性的变化趋势与几丁质酶活性变化完全相反，推测植物在不同时期对病原菌侵染的应答不同。

2. 3 与黑穗病菌长期互作中甘蔗内源激素含量的变化

2. 3. 1 IAA含量变化 由图5可看出，接种黑穗病菌后30、60和90 d，抗病品种GT29的IAA含量均高于对照，其中在接菌后60 d含量最高（554.39 ng/gFW），接菌后180 d，IAA含量降至最低（-271.07 ng/gFW）。感病品种Yacheng 71-374的IAA含量在接菌后30和60 d时较对照升高，在接菌后90和180 d时较对照降低，其中180 d时的含量最低（-1359.54 ng/gFW）。IAA含量变化趋势与几丁质酶活性变化趋势完全相同，其在甘蔗感病后期含量降低，表明在抵御黑穗病菌侵染时，IAA含量可能与几丁质酶的表达存在一定联系。

2. 3. 2 CTK含量变化 由图6可看出，在接种黑穗病菌后的30、60、90和180 d，与对照相比，抗病品种GT29的CTK含量变化趋势为“升—升—降—降”，在接菌后30 d CTK含量最高（22.49 ng/gFW）。感病品种Yacheng 71-374的CTK含量变化趋势为“升—升—升—降”，在接菌后60 d其CTK含量最高（7.94 ng/gFW），此后呈逐渐降低趋势。CTK含量变化趋势与IAA含量变化相似，但在接菌后90 d时有所不同。

2. 3. 3 ETH含量变化 由图7可看出，在接种黑穗病菌后的30、60、90和180 d，与对照相比，抗病品种GT29的ETH含量变化趋势为“升—降—升—升”，而感病品种Yacheng 71-374的ETH含量一直低于对照且整体上呈下降趋势。GT29的ETH含量在不同时期均高于Yacheng 71-374。

3 讨论

植物在受到病菌入侵后会启动一系列防卫反应来增强自身免疫力，阻止或延缓病原菌进一步侵染。本研究发现，在甘蔗与黑穗病菌长期互作过程中，其叶片中与抗性有关的酶活性及激素含量不断变化，可能反映出不仅植物会启动一系列防卫反应，病原菌也会不断发生相应的适应变化，是一个复杂的互作过程。

几丁质酶可降解幼嫩菌丝细胞壁，而成熟菌丝细胞壁主要成分为几丁质和β-1，3-葡聚糖。几丁质酶能催化几丁质进而抑制真菌菌丝的生长和繁殖（Adams，2004）；β-1，3-葡聚糖酶不仅可破坏病原菌细胞壁抑制真菌的生长，其水解产物——寡糖产物还可作为激发子诱导植物抗性系统（王廷璞等，2010）。因此，几丁质酶与β-1，3-葡聚糖酶常共同作用来抑制真菌生长，增强植物对病原菌的抗性（陈爱葵等，2010）。在本研究中，几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶活性变化相似，但在接种黑穗病菌后60和90 d时存在差异，其原因可能是黑穗病菌在不同时间生长发育情况不同，或还有其他物质参与调控，如β-1，3-葡聚糖酶易受水杨酸、乙烯、脱落酸等物质的调控（苏亚春，2014）。甘蔗在感染黑穗病前期感病品种Yacheng 71-374的几丁质酶活性高于抗病品种GT29。根据刘守伟等（2009）的研究结果，黄瓜在接种枯萎病后，抗性品种的几丁质酶活性在48和72 h两次达峰值，感病品种只在60 h时达峰值。推测抗病品种GT29的几丁质酶活性在接种黑穗病菌后的前30 d已出现表达峰值，早于感病品种Yacheng 71-374。本研究重点观察酶活性的整体变化趋势，发现整个感病过程甘蔗叶片中几丁质酶活性呈逐步降低的趋势。

目前已证实，植物在遭受与氧化反应相关的生物或非生物胁迫时，CAT可保护植物免受或减少氧化损伤（Mhamdi et al.，2010）。本研究发现，两个甘蔗品种叶片CAT活性与几丁质酶活性的变化趋势完全相反，CAT活性呈逐步上升趋势。在感病前期CAT活性降低，可能是病原菌入侵后植物最初的防卫反应是增加活性氧产生，造成局部细胞死亡，进而阻止病原菌进一步侵染，增加的活性氧主要为过氧化氢，对CAT活性造成竞争性抑制，与Peters等（2017）的研究结果一致。不仅植物会产生过氧化氢，已有研究发现病原菌也会在植物中释放和积累过氧化氢。李欣（2007）通过检测多株植物黄单胞菌菌株CAT释放情况，发现几乎所有病原菌细胞中均有过氧化氢的产生和积累，说明病原菌也会造成植物的氧化损伤。故推测在感病前期，植物主要通过几丁质酶、β-1，3-葡聚糖酶和增加活性氧等来延缓病原菌侵染；在感病后期，黑穗病菌已大量繁殖，植物通过CAT等来清除病原菌造成的损伤。

本研究发现，甘蔗感染黑穗病后叶片的IAA含量与几丁质酶活性变化趋势完全相同；CTK含量除接菌后90 d时，其他时期与几丁质酶活性变化也相同。离体研究结果表明，IAA和CTK会调控烟草几丁质酶的表达（欧阳石文等，2002）。许多植物病原菌可自身产生IAA或控制植物的IAA合成，进而破坏寄主的生长和发育，植物同样可能通过调控其他通路来保护自己（王晓莉，2008）。整体推测，随着黑穗病菌的不断入侵、蔓延，抑制了植物体内IAA和CTK等的合成，进而几丁质酶活性降低，这时植物会通过增加CAT活性等来降低病原菌侵染的影响。

本研究还发现，抗性品种GT29的β-1，3-葡聚糖酶活性和ETH含量在整个研究时期均高于感病品种Yacheng 71-374。该结果也暗示了ETH对植物抗病有积极作用，可能是不同抗性品种在应答黑穗病侵染防御机制方面存在差异的重要生理生化基础。尽管β-1，3-葡聚糖酶活性和ETH含量与抗病能力间存在一定相关性，但由于植物防御系统很复杂且有许多其他因素组成，今后此方面还需进一步研究。

4 结论

通过研究甘蔗与黑穗病菌长期互作过程中抗性相关酶活性和内源激素含量变化，发现几丁质酶、β-1，3-葡聚糖酶活性及IAA和CTK含量總体上呈下降趋势，而CAT活性呈上升趋势。表明甘蔗在不同时期应答黑穗病菌胁迫的生理生化反应不同，感病品种与抗病品种的防御机制可能存在差异，对于其作用机制尚需进一步研究。

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（责任编辑 王 晖）