广西现行家蚕品种两广二号原种随时孵化技术

李燕飞 李乙 蒋玉莲 韦红群 何珊珊 莫云霞

摘要：【目的】明確保护时间、冷藏时间和浸酸时间3个因素对两广二号原种短期冷藏浸酸及延期冷藏浸酸实用孵化率的影响，为调节蚕种供应期及广西家蚕原种短期冷藏浸酸处理过程中制定不同冷藏时间的蚕种入库和盐酸刺激量标准提供依据，也为改进当前的短期冷藏浸酸技术提供指导。【方法】以两广二号原种4个亲本（芙蓉×932、932×芙蓉、湘晖×7532和7532×湘晖）为试验材料，按入库前保护时间、冷藏时间及浸酸时间3个因素3水平设计正交试验，调查4个亲本各因素不同水平的实用孵化率，筛选提高实用孵化率的最佳组合，并在此基础上选取孵化效果较好的亲本探讨延期冷藏适期。【结果】通过正交试验分析，4个亲本在不同冷藏天数中均可找到各因素条件较好的最高实用孵化率处理组合，其中，芙蓉×932为48 h-30 d-6 min，932×芙蓉为48 h-30 d-5 min，湘晖×7532为48 h-30 d-7 min，7532×湘晖为64 h-40 d-6 min。短期冷藏孵化效果较好的两个亲本（芙蓉×932和湘晖×7532）延期冷藏试验区与对照区的实用孵化差异不显著（F关键词： 家蚕；两广二号；短期冷藏；浸酸；实用孵化率

中图分类号： S882.35 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）04-0787-07

Instantaneous hatching technique for silkworm variety Liangguang 2 stock in Guangxi

LI Yan-fei， LI Yi， JIANG Yu-lian， WEI Hong-qun， HE Shan-shan， MO Yun-xia*

（Guangxi Academy of Sericulture Science， Nanning 530007， China）

Abstract：【Objective】The effects of three factors including protection time， refrigeration time and acid soaking time on the practical hatching rate of short-term refrigeration and acid treatment， and deferred short-term refrigeration and acid treatment for Liangguang 2 stock were studied to provide references for the adjustment of silkworm egg supply period， the standard formulation on the storage of silkworm eggs and acid stimulus dose in the process of short-term refrigeration and acid treatment of silkworm stock in Guangxi，as well as the improvement of existing short-term refrigeration and acid soaking treatment technology. 【Method】Four parents of Liangguang 2 stock（Furong×932， 932×Furong， Xianghui×7532， 7532×Xianghui） were used as the test materials. Orthogonal test with three levels of three factors including protection time， refrigeration time and acid soaking time was designed to investigate the practical hatching rate of four parents at different levels of factors. The purpose was to find the best combination for increasing hatching rate， and on this basis， parents with fine hatching results were selected to study suitable period of deferred refrigeration. 【Result】Through the analysis of orthogonal test， treatment combination of the highest practical incubation rate with desirable factors can be found in diffe-rent refrigerated days for the four parents. In which， Furong×932， 932×Furong，Xianghui×7532 and 7532×Xianghui were 48 h-30 d-6 min， 48 h-30 d-5 min， 48 h-30 d-7 min and 64 h-40 d-6 min respectively. There was not significant difference in practical hatchability between experimental plot and control plot for deferred refrigeration of two parents（Furong×932 and Xianghui×7532） which had sound hatching effects in short-term refrigiration（F

Key words： silkworm； Liangguang 2； short-term refrigeration； acid soaking； practical hatching rate

0 引言

【研究意义】广西家蚕原种秋用种主要为春制秋用种，一般采用短期冷藏浸酸法解除滞育，生产上需在5 ℃下冷藏60 d以上出库浸酸才能保证孵化整齐（余爱群等，1997；余武昌等，2012）。随着我国“东桑西移”政策的实施，广西蚕业迅速发展，原种需求量大幅增长，需提早出库浸酸以满足各蚕种场的用种需求，进而产生蚕种用种提前与蚕种冷藏时间不足的矛盾。此外，生产上常受天气、市场等因素影响导致用种期延后的情况时有发生，而需要不间断供应蚕种。为适应养蚕生产及品种变化的需要，蚕业科技工作者不断改进蚕种解除滞育的方法，摸索出短期冷藏保护及浸酸后再冷藏等系列技术体系，但在蚕种冷藏期限上仍存在缺陷，无法满足完全开放蚕种市场随时供应蚕种的需求（胡木林和黄自然，1999；陈义安等，2016），因此，有必要进一步探索保护时间、冷藏时间、浸酸时间等因素对蚕种实用孵化率及蚁蚕绝食生命力的影响，为广西家蚕原种短期冷藏浸酸处理过程中制定不同冷藏时间的蚕种入库和盐酸刺激量标准提供依据，进而拓宽蚕种使用期限以满足广西全年多批次、循环式养蚕的生产需求。【前人研究进展】近年来，为适应蚕业发展需求，蚕业科技工作者一直致力于提高短期冷藏蚕种孵化率及随时解除蚕种滞育性方法的研究。杨明观等（1996）采用电晕放电刺激法对冷藏25～30 d的短期冷藏蚕种进行人工孵化处理，结果获得与浸酸相当或略优的人工孵化效果。余爱群等（1997）对卵龄为42～72 h的蚕种进行冷藏0～25 d后随时孵化研究，结果获得91%～99%的实用孵化率，且在生产上应用效果良好。徐世清等（2000）研究表明，在一定的鹽酸刺激量范围内，蚕卵活化和发育速度随盐酸刺激量的增大而加快，但刺激量超过一定范围后蚕卵的点青时间随刺激量的增大而延迟。邵金丽等（2004）研究证实，蚕卵产下后在25 ℃保护1～7 d的未完全滞育卵，用1.075 kg/L盐酸（液温46 ℃）浸渍5～70 min，其实用孵化率可达90%左右；当蚕卵产下后在25 ℃保护10～20 d时，用高温冲击加浸酸的方法可解除其滞育性。贾玉霞等（2005）利用高温冲击法对蚕种冷藏35～40 d的短期冷藏方法进行研究，并应用于生产，其蚕种孵化率高，农户反应良好。章豪等（2010）发现932×芙蓉或芙蓉×932杂交原种在24～25 ℃的条件下保护72 h（卵色转至赤豆色），再将其置于5 ℃的冷库中冷藏，15 d后进行人工浸酸孵化，浸酸7～9 min，其实用孵化率在96%以上。蒋龙元（2014）设置不同盐酸比重、盐酸液温、浸酸时间研究分析家蚕冷藏浸酸种对盐酸刺激量的承受能力。莫云霞等（2016）采用不同的浸酸时间和盐酸刺激量进行处理，调查桂蚕N2原种催青蚕卵发育情况及蚕种孵化成绩，旨在找出该品种冷藏浸酸种的最适浸酸范围。徐杰等（2016）对比研究了不同冷藏时间条件下，常温浸酸对浙江省现行生产使用家蚕品种孵化率的影响。【本研究切入点】目前，国内虽然已有大量研究探讨了影响短期冷藏浸酸蚕种的因素及提高其实用孵化率的途径和措施，但全国各蚕区的家蚕品种、冷藏标准和冷藏浸酸方式并未统一，即使是同一家蚕品种，也会随品种逐年繁育及推广地区气候条件和原种繁育技术的差异，导致品种发生遗传变异（陈涛等，2012），因此有必要结合当地的桑蚕生产习惯，制定出适宜的蚕种入库和盐酸刺激量标准体系。【拟解决的关键问题】根据广西蚕业生产出现原种生产供应与冷藏不足的问题进行设计，于2012～2016年在广西现行家蚕品种两广二号原种短期冷藏浸酸的基础上，探讨保护时间、冷藏时间和浸酸时间3个因素对实用孵化率及延期冷藏实用孵化率和蚁蚕绝食生命力的影响，为调节蚕种供应期及广西家蚕原种短期冷藏浸酸处理过程中制定不同冷藏时间的蚕种入库和盐酸刺激量标准提供依据，也为改进当前的短期冷藏浸酸技术提供指导。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

供试材料为广西现行家蚕品种两广二号原种4个亲本，分别为芙蓉×932、932×芙蓉、湘晖×7532和7532×湘晖，由广西蚕业科学研究院原种场2014年下半年生产提供。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 超短期冷藏原种最佳条件正交试验 根据库前保护时间、冷藏时间及浸酸时间3个因素3水平进行正交设计，每个品种均设9个试验小区，即采取L9（34）正交试验，每个试验区设10个蛾圈重复。每个试验亲本选取同期羽化、形体适中、健康、成熟的母蛾产卵，产卵时间控制在6 h内，产卵后将蚕卵置于25 ℃、湿度75%～85%的环境中保护。为减少母蛾区间差异，利用肉眼鉴别与卵龄相结合的方法，选择卵色一致且死卵少的卵圈，一蛾圈四分，随机搭配。经48、56和64 h的保护后，入库冷藏（经中间温度10～12 ℃冷藏6 h后入5 ℃内库冷藏），分别于冷藏20、30和40 d时将蚕种出库浸酸。盐酸刺激量与盐酸液温、盐酸浓度及浸渍时间三者呈正相关，为了操作方便，固定盐酸液温（48 ℃）和浓度（比重1.093），以不同浸渍时间代表盐酸刺激量的变化（余武昌等，2011）。中系品种（芙蓉×932和932×芙蓉）浸酸时间以目前生产上的浸酸标准时间（5 min）为中心，设4、5和6 min 3个浸酸水平；日系品种（湘晖×7532和7532×湘晖）浸酸时间以目前原种生产上的浸酸标准时间（6 min）为中心，设5、6和7 min 3个浸酸水平。浸酸后蚕卵在25 ℃、湿度75%～85%的环境中恒温催青，分别调查各处理区的蚕卵孵化数和未孵化数，统计实用孵化率。

1. 2. 2 超短期冷藏原种延期冷藏试验 每个试验亲本选取同期羽化、形体适中、健康、成熟的母蛾产卵，产卵时间控制在6 h内，产卵后将蚕卵置于25 ℃、湿度75%～85%的环境中保护。每个品种的试验区（入库保护48 h）和对照区（入库保护72 h）分别设3个重复，每个重复以8个卵圈（随机选32个1/4卵圈）为一个试验区，每个亲本设6个试验区。按设计随机搭配好后入库冷藏（经中间温度10～12 ℃冷藏6 h后入5 ℃内库冷藏），于冷藏60 d时将蚕种出库浸酸。按生产浸酸标准（液温48 ℃、比重1.093、浸酸时间为中系品种5 min、日系品种6 min）浸酸，浸酸后蚕卵在25 ℃、湿度75%～85%的环境中恒温催青，蚕种出现苗蚁后逐日于上午9：00时调查实用孵化率。蚁蚕绝食生命力调查是每个试验区取同天孵化的蚁蚕300头左右（黄扬玉等，2011），分别用白纸包好，置于25～26 ℃、湿度75%～80%的条件下进行绝食处理，待蚁蚕自然死亡时逐日于上午9：00时调查蚁蚕死亡头数，直至全部死亡。以蚁蚕死亡率达50%时的经过时间为绝食经过时数。

1. 3 统计分析

以Excel 2007对试验数据进行整理和制图，并采用SPSS 20.0进行方差分析和差异显著性检验。

2 结果与分析

2. 1 原种超短期冷藏条件下各因素的孵化效应

从表1可知，芙蓉×932、932×芙蓉和湘晖×7532冷藏20～40 d，均能找到实用孵化率在92.00%以上的处理组合，其中，芙蓉×932有5个，932×芙蓉有6个，湘晖×7532有8个。但在20 d的冷藏时间中，7532×湘晖未找到实用孵化率达92.00%以上的处理组合。

从表2可看出，4个亲本实用孵化率最高的处理组合分别是：芙蓉×932为48 h-30 d-6 min，932×芙蓉为48 h-30 d-5 min，湘晖×7532为48 h-30 d-7 min，7532×湘晖为64 h-40 d-6 min。除7532×湘晖外，其他亲本均以保护48 h的实用孵化率最高，且随保护时间的增加实用孵化率呈降低趋势，故推测这些品种含多化性血统较多，发育快。

由表3可知，在本研究设计的因素水平中，3个因素对各亲本的作用程度各不相同，其中，浸酸时间对芙蓉×932所起作用显著[F=19.49>F0.05]，但对其他亲本所起作用不显著（FF0.05]，对其他亲本所起作用不显著；保护时间对4个亲本所起作用均不显著。

2. 2 4个亲本特点分析

2. 2. 1 芙蓉×932 从保护时间来看，以保護48 h的实用孵化率最高，故推测芙蓉×932在经过56 h保护后部分蚕卵滞育程度较深，解除滞育难。从冷藏时间来看，实用孵化率随冷藏时间的增加而降低，说明此时该亲本在40 d的冷藏期限内仍然缓慢越年化。方差分析结果（表3）表明，浸酸时间对其实用孵化率影响显著，说明盐酸对芙蓉×932的刺激效果显著，能有效提高其孵化率。从表4可看出，浸酸6 min的实用孵化率极显著高于浸酸4和5 min（P<0.01，下同），说明该品种耐酸力较强。在短期冷藏浸酸条件下，适当加大盐酸刺激量，能有效提高蚕种的实用孵化率和孵化整齐度。

2. 2. 2 932×芙蓉 从极差分析结果（表2）可知，各因素最优水平及主次排序为保护时间48 h>冷藏时间30 d>浸酸时间5 min。方差分析发现，3个因素在设置的3个水平上对实用孵化率无显著差异，但由于每个因素不同水平处理的平均实用孵化率均有低于92.00%的组合出现（保护56 h的平均实用孵化率为90.42%，冷藏20 d的平均实用孵化率为90.51%，浸酸6 min的平均实用孵化率为90.97%），说明冷藏时间过短或浸酸时间过长均会影响孵化效果，优化3个因素的组合对于提高孵化率仍存在一定难度。

2. 2. 3 湘晖×7532 湘晖×7532的实用孵化率随保护时间的增加而降低，故推测该品种较快进入滞育，但3个冷藏时间水平间的实用孵化率差异不明显。从浸酸时间来看，其实用孵化率随浸酸时间的增加而升高，可适当加大盐酸刺激量以提高孵化率。从方差分析结果来看，保护时间、浸酸时间、冷藏时间3个因素对其实用孵化率的影响不显著，且不同因素不同水平的组合均能获得符合生产标准的孵化率，说明湘晖×7532对3个因素的适应范围较宽，在短期冷藏入库时可优先考虑该品种进行短期冷藏浸酸处理。

2. 2. 4 7532×湘晖 综合极差分析和方差分析结果可知，保护时间和浸酸时间在3个水平上的实用孵化率差异不明显，但实用孵化率随冷藏时间的延长而升高，说明随着冷藏时间的延长，蚕种的孵化机能和耐酸力均呈上升趋势。从表4可看出，冷藏30和40 d的平均实用孵化率极显著高于冷藏20 d，说明该品种不宜提早出库，冷藏时间不少于30 d的孵化率才有保障。冷藏20 d的实用孵化率显著下降的原因是浸酸死卵和催青死卵较多，说明该品种在经20 d冷藏后耐酸力较低，极易产生浸酸死卵，因此在短期冷藏中应尽量避免安排该品种进行短期出库处理。此外，该品种实用孵化率最高的浸酸时间为6 min，浸酸5和7 min的实用孵化率稍低，主要是5 min的浸酸刺激不够，部分未孵化的蚕卵影响实用孵化率，而7 min的浸酸刺激稍过，部分浸酸死卵和催青死卵影响实用孵化率，说明该品种不耐酸，且浸酸安全范围窄。

2. 3 短期冷藏蚕种延期冷藏的孵化率调查结果

由表5可看出，两个亲本试验区和对照区的平均孵化率均超过92.00%，符合生产要求。其中，芙蓉×932试验区的平均实用孵化率为94.09%，略高于其对照区（93.10%）；湘晖×7532试验区的平均实用孵化率为93.31%，略低于其对照区（94.26%）。蚕种实用孵化率经反正弦角转换后进行方差分析，结果发现两个亲本的试验区和对照区差异均不显著（P>0.05），说明芙蓉×932和湘晖×7532的短期冷藏种延期冷藏后对实用孵化率影响不明显。

2. 4 短期冷藏蚕种延期冷藏的蚁蚕生命力调查结果

由表6可看出，芙蓉×932试验区蚁蚕的自然死亡时间从饥饿48 h开始，对照区则是从饥饿72 h开始；试验区中有1个处理的少量蚁蚕存活到192 h，而对照区有2个处理的少量蚁蚕存活到192 h；试验区和对照区蚁蚕饥饿至120 h的累计死亡率均超过50.00%，即芙蓉×932试验区和对照区绝食经过时数为120 h。湘晖×7532试验区和对照区蚁蚕的自然死亡时间均从饥饿48 h开始，试验区蚁蚕只存活到168 h，而对照区有2个处理的少量蚁蚕存活到192 h；试验区和对照区蚁蚕饥饿至120 h的累计死亡率均超过50.00%，即湘晖×7532试验区和对照区绝食经过时数也为120 h。方差分析结果表明，同时间内芙蓉×932和湘晖×7532两个亲本试验区与对照区的蚁蚕死亡率差异不显著，说明这两个亲本经短期冷藏后再延期冷藏对蚁蚕的强健性无不良影响。

3 讨论

生产上，不同家蚕品种对滞育的解除条件会有其特定要求，只有最适的解除条件才能获得最佳的孵化效果。胡木林和黄自然（1999）研究表明，品种及不同批次均会影响蚕卵滞育解除的难易程度。邵金丽等（2004）研究表明，不同家蚕品种滞育卵对高温冲击浸酸法解除滞育的敏感性也不同。在本研究中，芙蓉×932、932×芙蓉和湘晖×7532均以在48 h入库保护的平均实用孵化率最高，7532×湘晖则以在64 h入库的平均实用孵化率最高；7532×湘晖对冷藏时间最敏感，冷藏20 d与冷藏30 d的实用孵化率存在极显著差异；日系品种中湘晖×7532比7532×湘晖耐酸，中系品种中芙蓉×932比932×芙蓉耐酸，其中芙蓉×932和湘晖×7532通过加大盐酸刺激量可有效提高其实用孵化率，尤其是芙蓉×932，盐酸刺激量对提高孵化率有极显著作用，而932×芙蓉和7532×湘晖在短期冷藏中的浸酸安全范围很窄。因此，实际生产中蚕种提早出库首先要选择耐酸力强的品种。

家蚕品种、入库前保护时间、冷藏时间、浸酸时间同时影响短期冷藏浸酸种对浸酸的敏感性（余武昌等，2012）。本研究通过正交试验设计，发现芙蓉×932、932×芙蓉和湘晖×7532冷藏20～40 d均能找到实用孵化率在92.00%以上的处理组合，其中，芙蓉×932有5个，932×芙蓉有6个，湘晖×7532有8个；但在20 d的冷藏中，7532×湘晖并未找到实用孵化率达92.00%以上的处理组合。4个亲本实用孵化率最高的处理组合分别为：芙蓉×932为48 h-30 d-6 min，932×芙蓉为48 h-30 d-5 min，湘晖×7532为48 h-30 d-7 min，7532×湘晖为64 h-40 d-6 min。其中，超短期冷藏浸酸孵化效果较好的亲本是芙蓉×932和湘晖×7532，二者试验区与对照区的实用孵化率差异均不显著；两个亲本试验区和对照区蚁蚕的绝食经过时数同为120 h，且同一时间内试验区和对照区的蚁蚕死亡率差异也不显著，说明短期冷藏种经延期冷藏后对蚕种的实用孵化率和蚕种蚁蚕强健性无不良影响，故确定这两个亲本的短期冷藏种延期冷藏到60 d时最安全可行，可实现全年不间断供应蚕种及随时孵化的需求，适应广西新时期蚕种市场完全开放的特点。

蒋龙元（2014）认为，在国内几乎所有蚕区在蚕种的冷藏浸酸处理方法中，均针对不同冷藏时间规定了严格的蚕种入库和盐酸刺激量标准。这些严格的标准虽然对于规范蚕种浸酸孵化处理有很好的作用，但对实际生产出现的延迟入库，或冷藏时间变化及蚕品种不同等情况的适应性，仍存在需要改进完善的地方。本研究结果也表明，盐酸刺激强度需根据入库时的卵龄即滞育程度而定，综合考虑入库冷藏后的蚕卵是否继续滞育还是开始活化，并根据实际情况适当调整冷藏浸酸标准，方可获得稳定理想的实用孵化率。

4 结论

保护时间、冷藏时间和浸酸时间3个因素均对蚕种实用孵化率有一定影响，在实际生产中，蚕种提早出库首先要选择耐酸力强的品种，其次要根据入库时的卵龄即滞育程度确定盐酸刺激强度，最后在入库冷藏时间到期后分批取出蚕卵解剖，了解蚕种的滞育进程。同时根据生产成本、劳动条件等实际情况，适当调整冷藏浸酸标准，即可获得最符合实际生产的理想实用孵化率。

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（责任编辑 兰宗宝）