DNA甲基化与肺动脉高压患病风险相关性的研究进展

朱才民　李旎　孙乐波　郑大为　石活顺　徐国栋　邵国丰

【摘要】 肺动脉高压是一种严重而无法治愈的肺血管疾病，其发病机制复杂。DNA甲基化是在甲基化转移酶的作用下调控基因选择性转录表达的表观遗传学修饰。近期研究发现，DNA甲基化在肺动脉高压的发生、发展过程中起着重要作用。该文就近年来对DNA甲基化影响肺动脉高压形成的研究作一综述。

【关键词】 肺动脉高压；DNA甲基化；基因；表观遗传学

【Abstract】 Pulmonary arterial hypertension is a serious and incurable pulmonary vascular disease with complex pathogenesis. DNA methylation is an epigenetic modification that electively regulates the transcriptional expression of genes under the action of methyltransferase. Recent studies have demonstrated that DNA methylation plays a crucial role in the incidence and progression of pulmonary arterial hypertension. This review summarizes recent studies focusing upon the effect of DNA methylation on the incidence of pulmonary arterial hypertension.

【Key words】 Pulmonary arterial hypertension； DNA methylation； Gene； Epigenetics

肺動脉高压（PAH）是以肺血管阻力进行性升高，肺动脉平均压力升高为其特性的一种病理生理状态，最终致使患者右心功能衰竭而死亡，且发病以女性为主，女∶ 男比例约为2.3∶ 1，若未及时诊断并积极干预，患者一般在出现症状后2～3年内死亡[1-2]。血流动力学诊断标准为：在海平面、静息状态下，右心导管测量mPAP≥25 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）[3-4]。PAH分为原发性和继发性两类。原发性肺动脉高压（PPH）是目前原因不明的肺动脉高压，属致命性PAH，是一种少见疾病，包括特发性肺动脉高压（IPAH）与家族性肺动脉高压（FPAH）。继发性PAH可发生于重症慢性肺部疾病、心脏瓣膜病、冠状动脉粥样硬化性心脏病（冠心病）、先天性心脏病、风湿性心脏病、艾滋病等，除有PAH的表现外，还有原发病的表现，继发性肺动脉高压较常见[5]。虽然近年来随着靶向药物上市及临床诊疗路径的规范使得PAH患者生存率有所提高，但从长期看，预后仍不容乐观。

大量研究结果表明，PAH的发生是遗传因素和环境因素共同作用的结果，而表观遗传学正是从遗传-环境交互作用的角度来探讨疾病的发生[6-7]。目前对PAH进行DNA甲基化方面的研究很少。然而在其他领域比如癌症研究中却十分常见，比如DNA甲基化作为核酸类的肿瘤标记物，在胰腺癌的诊断方面具有明显优势已被证实[8]。这些说明在PAH领域中，亟需开展表观遗传学方面的研究。随着遗传学技术进步，有关PAH的易感基因和致病基因被陆续发现。近年来对IPAH的发病机制研究不断深入，最为重要的进展即在分子遗传方面发现PAH具有易感性。另外，PAH体外肺动脉内皮细胞培养表现为高增殖活性，抗凋亡倾向，与肿瘤发生机制相似，PAH可能是由于肺血管细胞遗传学改变所致[9]。

DNA甲基化是在甲基化转移酶的作用下调控基因选择性转录表达的表观遗传学修饰。而越来越多的研究表明PAH患者基因组存在DNA甲基化，并且相关基因的甲基化也逐渐被提及。现依据近些年来关于DNA甲基化修饰与PAH患病风险的相关性研究结果作一综述。

一、 DNA甲基化修饰

在人所有基因组中大约60% ～90%的胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤（CpG）是被甲基修饰的，但CpG岛是未被甲基化修饰的[10]。因此DNA甲基化是相对稳定的表观遗传学修饰，甚至可以由细胞遗传。一旦DNA甲基化转移酶（DNMT）调节出现紊乱时，催化腺苷或胞嘧啶DNA核苷酸通过共价相互作用添加甲基使DNA构象发生改变，阻碍基因转录，使得基因表达受到限制。具有特定碱基序列的CpG岛序列通常位于基因启动子中，可以发生较高的甲基化概率，被认为是隐性遗传的一个标志。DNA甲基化完成转录抑制可能通过以下3条途径完成：①直接屏蔽转录因子结合位点；②募集转录调节阻遏蛋白；③改变染色质结构，抑制基因表达[11]。近些年来，随着基因芯片技术及高通量测序技术的发展，对人全基因组甲基化谱的研究逐年增多，涉及多个领域范围，这些研究大大提高了人类对DNA甲基化在疾病中整体影响的认识。

二、 DNA甲基化及肺血管重塑与PAH的关系

DNA甲基化可以调节某些被甲基化区域的基因表达和血管平滑肌细胞的分化从而促使PAH的形成[12]。PAH的致病基因活化素受体类激酶1（ACVRL1/ALK1）的表达主要集中于血管内皮细胞中，并受CpG岛甲基化控制，介导ACVRL1/ALK1启动子区域的转录因子Sp1[13]。持续性血管收缩和血管重塑是PAH的两个重要的病理变化。有学者证实，具有强烈血管收缩功能的内皮素-1受人肺动脉内皮细胞中胰岛素样生长因子-1（IGF-1）调控，在低氧诱导肺动脉小鼠模型中，IGF-1启动子区域有一个特定的胞嘧啶甲基化位点是对缺氧作出反应的，因此推测IGF-1基因甲基化可能调控内皮素-1形成从而对小鼠PAH形成发挥作用[14]。不同刺激（如受伤和缺氧）会导致肺动脉壁结构和功能上的改变，随后引起细胞存活和凋亡之间的不平衡，从而引发了肺血管的重塑，超氧歧化酶2（SOD2）启动子区域CpG岛甲基化引起氧化还原反应信号通路受损，从而造成肺动脉平滑肌细胞（PASMC）的增殖与凋亡抵抗，最终引发PAH[15-16]。肺动脉压力的增加伴随着肺血管重塑的不断增加，DNA甲基化参与调控PAH的肺血管重塑。

三、 相关基因甲基化与PAH的关系

1.编码SOD2基因

SOD2基因编码线粒体中的SOD。SOD2是一种由过氧化氢（H2O2）参与监管的酶，与低氧诱导因子-1α（HIF-1α）相互作用，也有肿瘤抑制基因的作用[17]。在SOD2介导的细胞增殖和凋亡中，PASMC受到影响，首先在fawn-hooded大鼠模型和IPAH患者中被证实，而在人PAH中，肺动脉和从状病变中发现SOD2的缺乏[18]。Archer等[16]证实在自发性PAH的fawn-hooded大鼠模型和人高度增殖的平滑肌细胞中SOD2基因表达下降，导致线粒体低极化，引起氧化还原反应信号通路受损，损害了机体氧化应激信号通路，激活HIF-1α，使得PASMC过度增生，调亡抵抗，从而诱发PAH，且SOD2表达的下降主要是通过SOD2启动子区域CpG岛DNA甲基化引起SOD2基因转录抑制所致。调节5-氮杂胞苷（甲基转移酶抑制剂）逆转了甲基化和增加了SOD2的表达。随后fawn-hooded大鼠模型中增加SOD2降低了平均肺动脉压力和动脉厚度。这些发现清晰地凸显了通过SOD2和HIF-1α致使PASMC增殖的表观遗传通路，并为PAH的治疗提供了新的靶点。

2.IGF-1基因表达

Perkett通过对山羊持续性空气栓塞12 d形成PAH模型，发现IGF-1在第2日时显著升高，并在12 d中持续升高[19]。IGF-1对肺血管平滑肌细胞有促进其增殖的作用，并促使肺血管重塑，在低氧刺激下，IGF-1信号在肺动脉内皮细胞和平滑肌细胞呈激活状态，IGF-1参与低氧性肺血管重塑，以内分泌和自分泌/旁分泌方式刺激血管平滑肌细胞增生肥厚[20-21]。IGF-1基因的mRNA表达与DNA甲基化及组蛋白修饰关联密切，其通过调节肺动脉内皮细胞表达内皮素-1而发挥作用，组蛋白脱乙酰酶（HDACs）调节IGF-1的表达。Zhao等[22]研究证实，HDAC1和HDAC5的水平在2组PAH患者和一组PAH大鼠模型中均高于对照组，并证实组蛋白乙酰化的表观遗传学修饰与PAH的发生发展有关系，而HDACs抑制剂可以对上述大鼠模型的PAH发生逆转。另外，Yang等[14]通过对小鼠的实验性研究发现，HDACs抑制剂抑制的HDACs将减少新生小鼠肺内低氧诱导的DNA甲基化总体水平和肺内IGF-1启动子区域周围的胞嘧啶甲基化水平。但是国内外关于HDACs抑制剂通过影响DNA甲基化从而影响IGF-1基因表达，致使PAH进一步发展的研究并不多，这可能是未来研究的一个新方向。

3.腺苷三磷酸结合盒转运体A1（ABCA1）

ABCA1是具有跨膜结构域的对称结构，近几年，对于ABCA1的研究是国内外的热点。其在胆固醇逆向转运、代谢及高密度脂蛋白代谢过程中发挥重要作用，国外学者证实ABCA1 DNA甲基化抑制了ABCA1的表达，造成体内胆固醇大量蓄积[23]。胆固醇在肺血管内积聚造成肺血管增粗，可能会引起PAH，国内有学者证实他汀类药物对PAH有治疗作用，从侧面证实了这一点[24]。炎症作用是PAH的发病机制之一，另外IL-8等炎症因子可参与血管重构和血管新生，使得PAH进一步进展[25]。在肺内ABCA1蛋白的表达与炎症反应密切相关，ABCA1介导的胆固醇运输活动与ABCA1抗炎活性有关[26]。炎症反应本身就是PAH的一个发病因素。国外学者实验证明，PAH肺动脉内皮细胞中ABCA1基因启动子序列与正常人相比呈高甲基化状态[19]。

4.与PAH有关的其他基因

除了以上3中研究较多的基因外，国内外报道较多的与PAH形成及发展有关的基因包括骨形态发生蛋白2基因、5-羟色胺转运体基因等，另外，PAH中，小窝蛋白、酸敏感钾离子通道蛋白3、SMAD9基因的突变已被证实，而这些基因的甲基化或多个基因表达水平协同作用可能都会导致PAH形成。

5.與PAH患病相关的基因

笔者收集了6例PAH和6名正常人作预实验，其中，病例组1包括4例可逆病人，病例组2包括2例不可逆病人。通过病例组1与对照组的比较，调整P值具有统计学意义的有4个基因。通过病例组2与对照组的比较，调整P值<0.05的有6个基因。2个病例组相比较，我们发现了16个调整P值<0.05的基因。之后，我们在有统计学差异的基因中筛选出位于编码区或者UTR区（非编码区）的候选基因，它们分别是：ABCA6（17q24.3），C13orf28（13q34），MMP27（11q24），COPB1（11p15.2），HLA-DRB6（6p21.3），HLA-DRB1（6p21.3），HLA-DRB5（6p21.3）[27]。这有助于说明肺动脉高压与基因位点的甲基化有着密切关联。

四、 总结与展望

大量研究结果表明，PAH的发生是遗传因素与环境因素共同作用的结果，而表观遗传学正是从遗传-环境相互作用的角度来探讨疾病的发生。目前越来越多的证据表明表观遗传学机制参与PAH的形成及发展，而DNA甲基化是主要的表观遗传调控机制之一，其对PAH影响的研究还处于初步阶段，在PAH领域中，亟需开展表观遗传学方面的研究。哪一些基因甲基化影响PAH，这些相关基因在什么时候发生甲基化，DNMT如何识别基因甲基化位点等等还需要更进一步深入研究。随着对PAH患者或动物模型的相关基因的差异甲基化和外周血全基因组的甲基化谱的进一步研究，将有助于我们对PAH发生发展的认识，并为PAH的治疗提供新的靶点。

参考文献

[1] Galiè N，Corris PA，Frost A， Girgis RE，Granton J，Jing ZC，Klepetko W，McGoon MD，McLaughlin VV，Preston IR，Rubin LJ，Sandoval J，Seeger W，Keogh A.Updated treatment algorithm of pulmonary arterial hypertension.J Am Coll Cardiol，2013，62（25 Suppl）：D60-D72.

[2] Gaine SP，Rubin LJ.Primary pulmonary hypertension.Lancet，1998，352 （9129）：719-725.

[3] Galiè N，Humbert M，Vachiery JL， Gibbs S，Lang I，Torbicki A，Simonneau G，Peacock A，Vonk Noordegraaf A，Beghetti M，Ghofrani A，Gomez Sanchez MA，Hansmann G，Klepetko W，Lancellotti P，Matucci M，McDonagh T，Pierard LA，Trindade PT，Zompatori M，Hoeper M，Aboyans V，Vaz Carneiro A，Achenbach S，Agewall S，Allanore Y，Asteggiano R，Paolo Badano L，Albert Barberà J，Bouvaist H，Bueno H，Byrne RA，Carerj S，Castro G，Erol ，Falk V，Funck-Brentano C，Gorenflo M，Granton J，Iung B，Kiely DG，Kirchhof P，Kjellstrom B，Landmesser U，Lekakis J，Lionis C，Lip GY，Orfanos SE，Park MH，Piepoli MF，Ponikowski P，Revel MP，Rigau D，Rosenkranz S，Vller H，Luis Zamorano J.2015 ESC/ERS Guidelines for the diagnosis and treatment of pulmonary hypertension：the Joint Task Force for the Diagnosis and Treatment of Pulmonary Hypertension of the European Society of Cardiology（ESC）and the European Respiratory Society（ERS）： Endorsed by：Association for European Paediatric and Congenital Cardiology（APEC），International Society for Heart and Lung Transplantation（ISHLT）. Eur Heart J，2016，37（1）：67-119.

[4] Hoeper MM，Bogaard HJ，Condliffe R， Frantz R，Khanna D，Kurzyna M，Langleben D，Manes A，Satoh T，Torres F，Wilkins MR，Badesch DB.Definitions and diagnosis of pulmonary hypertension.Turk Kardiyol Dern Ars，2014，42（suppl 1）：55-66.

[5] Nider V.Pulmonary arterial hypertension.Recognition is the first essential step.Adv NPs Pas，2013，4（5）：33-37.

[6] Aldred MA，Comhair SA，Varella-Garcia M， Asosingh K，Xu W，Noon GP，Thistlethwaite PA，Tuder RM，Erzurum SC，Geraci MW，Coldren CD.Somatic chromosome abnormalities in the lungs of patients with pulmonary arterial hypertension.Am J Respir Crit Care Med，2010，182（9）：1153-1160.

[7] Wang Y， Kahaleh B. Epigenetic repression of bone morphogenetic protein receptor Ⅱ expression in scleroderma.J Cell Mol Med，2013，17（10）：1291-1299.

[8] 周原，陸才德.DNA甲基化作为诊断标记物在胰腺癌诊断中的研究进展.新医学，2016，47（6）：349-353.

[9] Pullamsetti SS，Schermuly R，Ghofrani A，Weissmann N，Grimminger F，Seeger W.Novel and emerging the rapies for pulmonary hypertension.Am J Respir Crit Care Med，2014，189（4）：394-400.

[10] Nakao M.Epigenetics：interaction of DNA methylation and chromatin. Gene，2001，278（1-2）：25-31.

[11] 邱烈.CpG岛甲基化异常的致癌作用.检验医学与临床，2007，4（8）：746-748.

[12] Hiltunen MO，Yl-Herttuala S.DNA methylation，smooth musclecells，and atherogenesis.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2003，23（10）：1750-1753.

[13] Garrido-Martin EM，Blanco FJ，Fernandez-L A，Langa C，Vary CP，Lee UE，Friedman SL，Botella LM，Bernabeu C. Characterization of the human activin-A receptor type Ⅱ-like kinase 1（ACVRL1）promoter and its regulation by Sp1.BMC Mol Biol，2010，11（1）：1-22.

[14] Yang Q，Sun M，Ramchandran R，Raj JU.IGF-1 signaling in neonatal hypoxia-induced pulmonary hypertension：role of epigenetic regulation. Vascul Pharmacol，2015，73：20-31.

[15] Lee SJ，Smith A，Guo L，Alastalo TP，Li M，Sawada H，Liu X，Chen ZH，Ifedigbo E，Jin Y，Feghali-Bostwick C，Ryter SW，Kim HP，Rabinovitch M，Choi AM.Autophagic protein LC3B confers resistance against hypoxia-induced pulmonary hypertension.Am J Respir Crit Care Med，2011，183（5）：649-658.

[16] Archer SL，Marsboom G，Kim GH，Zhang HJ，Toth PT，Svensson EC，Dyck JR，Gomberg-Maitland M，Thébaud B，Husain AN，Cipriani N，Rehman J.Epigenetic attenuation of mitochondrial superoxide dismutase 2 in pulmonary arterial hypertension：a basis for excessive cell proliferation and a new therapeutic starget.Circulation，2010，121（24）：2661-2671.

[17] Li N，Oberley TD，Oberley LW，Zhong W.Overexpression of manganese superoxide dismutase in DU145 human prostate carcinoma cells has multiple effects on cell phenotype.Prostate，1998，35（3）：221-233.

[18] Bonnet S，Michelakis ED，Porter CJ， Andrade-Navarro MA，Thébaud B，Bonnet S， Haromy A，Harry G，Moudgil R，McMurtry MS，Weir EK，Archer SL.An abnormal mitochondrial-hypoxiainducible factor-1α-Kv channel pathway disrupts oxygen sensing andtriggers pulmonary arterial hypertension in fawn hooded rats： similarities to human pulmonary arterial hypertension. Circulation， 2006，113（22）：2630-2641.

[19] Hautefort A，Chesné J，Preussner J，Pullamsetti SS，Tost J，Looso M， Antigny F，Girerd B，Riou M，Eddahibi S，Deleuze JF，Seeger W，Fadel E， Simonneau G，Montani D，Humbert M，Perros F.Pulmonary endothelial cell DNA methylation signature in pulmonary arterial hypertension.Oncotarget，2017，8（32）：52995-53016.

[20] 吴淑会，刘臣.胰岛素样生长因子Ⅰ（IGF-Ⅰ）与各疾病的相关性研究进展.中国实验诊断学，2014，18（7）：1214-1216.

[21] 林勇，陈文彬，程德云.低氧性肺动脉高压大鼠血清IGF-1的变化.江苏医药，2010，26（4）：273-275.

[22] Zhao L，Chen CN，Hajji N，Oliver E，Cotroneo E，Wharton J，Wang D，Li M，McKinsey TA，Stenmark KR，Wilkins MR.Histone deacetylation inhibition in pulmonary hypertension：therapeutic potentialof valproic acid and suberoylanilide hydroxamic acid.Circulation，2012，126（4）：455-467.

[23] Liang Y，Yang X，Ma L，Cai X，Wang L，Yang C，Li G，Zhang M，Sun W，Jiang Y.Homocysteine-mediated cholesterol efflux via ABCA1 and ACAT1 DNA methylation in THP-1 monocyte-derived foam cells.Acta Biochim Biophys Sin（Shanghai），2013，45（3）：220-228.

[24] 卢献灵，何建国.他汀类药物治疗肺动脉高压的作用及机制.中华心血管病杂志，2010，38（10）：954-957.

[25] 宋钊，庞婷婷，范右飞， 王玉林.IL-8与肺动脉高压大鼠血管重构和血管新生的关系.新医学，2013，44（7）：508-518.

[26] Zhu X，Lee JY，Timmins JM，Brown JM，Boudyguina E，Mulya A，Gebre AK，Willingham MC，Hiltbold EM，Mishra N，Maeda N，Parks JS.Increased cellular free cholesterol in macrophage-specific ABCA1 knock-out mice enhances pro-inflammatory response of macrophages.J Biol Chem，2008，283（34）：22930-22941.

[27] Zheng D， Chen X， Li N， Sun L， Zhou Q， Shi H， Xu G， Liu J， Xu L， Duan S， Shao G. Differentially methylated regions in patients with rheumatic heart disease and secondary pulmonary arterial hypertension.Exp Ther Med，2017，14（2）：1367-1372.

（收稿日期：2017-10-06）

（本文編辑：杨江瑜）