建立自发缓解2型糖尿病动物模型可行性探讨

高日丽　林可意　谭莺　刘子瑜　许海霞

【摘要】 目的 探讨建立2型糖尿病自然病程中高血糖自发缓解现象动物模型的可行性。方法 将8只C57BL/6J品系雄性小鼠（体质量21 g）随机分为高脂饮食组（4只）和对照饮食组（4只），分别予高脂饲料（20%碳水化合物、20%蛋白质、60%脂肪）和匹配对照饲料（70%碳水化合物、20%蛋白质、10%脂肪）喂养。每周监测2组体质量、血糖、摄食量，为期12个月。高脂饮食诱导高血糖出现及自发缓解时行葡萄糖耐量实验、胰岛素耐量实验。观察终点检测2组小鼠血清胰岛素、血脂、肾脏功能及评价胰岛β细胞质量。结果 高脂饮食组空腹血糖呈现动态变化，第3个月开始出现空腹高血糖，与对照饮食组比较差异有统计学意义（P

【关键词】 高脂饮食；2型糖尿病；胰岛；血糖

【Abstract】 Objective To investigate the feasibility of establishing an animal model of type 2 diabetes mellitus with spontaneous remission. Methods Eight male C57BL/6J mice （body weight=21 g） were randomly divided into high-fat diet（n=4）and control groups（n=4）. In the high-fat diet group， high-fat diet including 20% carbohydrate， 20% protein and 60% fat was delivered. In the control group， the diet consisting of 70% carbohydrate， 20% protein and 10% fat was fed. The body weight， blood glucose level and feed intake between two groups were monitored weekly for 12 months. The incidence of hyperglycemia was induced by high-fat diet. Upon spontaneous remission， glucose and insulin tolerance tests were performed. At the end of the experiment， serum levels of insulin and lipid， renal function and the quality of islet βcells were evaluated between two groups. Results In the high-fat diet group， dynamic changes were detected in the fasting blood glucose level. The fasting hyperglycemia began to occur in the 3rd month， significantly differed from that in the control group （P0.05） until the end of the observation. The phenotype of hyperglycemia with spontaneous remission was accompanied with persistent increase in body weight， progression of insulin resistance， enlargement of the average islet area and significant elevation of serum insulin level. Conclusion The C57BL/6J mouse models of type 2 diabetes mellitus with spontaneous remission can be established by fed with high-fat diet for 12 months.

【Key words】 High-fat diet； Type 2 diabetes mellitus； Islet； Blood glucose

2型糖尿病（T2DM）是一種代谢综合征，其已成为严重危害公共健康的慢性疾病[1]。国际糖尿病联盟发布的数据显示，2015年全球20～79岁的人群中约有4.15亿糖尿病患者，全球大约每6 s即有1例糖尿病患者死亡，中国90%的糖尿病患者为T2DM[2-3]。目前认为T2DM的主要发病机制是胰岛素抵抗和（或）胰岛素分泌功能障碍，诊断时残存胰岛β细胞约为40% ～60%，诊断后胰岛β细胞功能呈进行性衰退[4]。另一方面，也有研究显示疾病自发缓解的现象，诊断后未接受降糖药物治疗的122 781例T2DM患者，研究者对其随访7年，病程小于2年的患者疾病自发缓解率为4.6%，且疾病缓解与短病程、基线时GHbA1c仅轻度升高、未进行降糖药物干预相关[5]。

为了进一步观察T2DM的自然病程及相关机制，需要建立T2DM自发诱导缓解的动物模型。超体质量、肥胖与T2DM的发生相关。在以高热量膳食干预方法建立的肥胖小鼠模型上可观察到胰岛素抵抗、高胰岛素血症、轻度高血糖、高血脂等类似于早期T2DM临床特征的表型，因而该模型被广泛应用于T2DM的基础研究[6]。既往研究者们常采用12～20周高脂饮食诱导C57BL/6J小鼠至其随机血糖稳定达11.1 mmol/L为造模成功。此时，研究者可开始实施不同的干预措施观察疾病进展或逆转。我们对C57BL/6J小鼠采用单纯高脂饮食喂养12个月，观察其空腹血糖的动态变化，以期了解建立自发性缓解的T2DM动物模型的可行性。

材料与方法

一、实验动物

8只6周龄健康C57BL/6J品系雄性小鼠（体质量21 g）购自南京大学模式动物研究所。所有小鼠饲养于中山大学附属第三医院实验中心SPF级动物房中，室温（20±2）℃，相对湿度40% ～70%，每日12 h光照，昼夜循环，自由饮食饮水。

二、材料及仪器

饲料购于美国Research Diets公司，血糖检测使用雅培Optium试纸，血清总胆固醇、甘油三酯、LDL-C、HDL-C、尿素和肌酐采用酶法测定（全自动生化分析仪）。胰岛素水平检测采用超敏酶联免疫吸附检测试剂盒（Mercodia），胰腺组织胰岛素（Cell Signalling）染色使用免疫组织化学（免疫组化）检测法。

三、实验方法

1.实验设计

8只小鼠适应性喂养2周后，根据体质量按随机数字表法将其分为高脂饮食组（4只）和对照饮食组（4只），分别予高脂饲料（20%碳水化合物、20%蛋白质、60%脂肪）和匹配对照饲料（70%碳水化合物、20%蛋白质、10%脂肪）喂养。每周记录小鼠摄食量、称量体质量并于尾静脉取血测空腹血糖（禁食6 h）。分别在高脂饮食诱导出空腹高血糖并持续3个月、空腹高血糖自发缓解并持续3个月时予所有小鼠行OGTT和胰岛素耐量试验（IPITT）。高血糖自发缓解指与对照饮食组相比空腹血糖值差异无统计学意义（P>0.05）。继续监测小鼠的摄食量、体质量和空腹血糖，总观察期12个月。观察终点处死小鼠，取全血分离血清于-80℃冻存，检测空腹血糖、胰岛素HOMA指数及总胆固醇等，取胰腺组织称量质量后用4%多聚甲醛固定、石蜡包埋常温保存。

2.OGTT

小鼠禁食15 h，称量体质量并测定空腹血糖，取 20%葡萄糖溶液以2 g/kg的剂量灌胃后开始计时，分别检测30、60、90、120 min小鼠尾静脉微量血糖水平。

3.IPITT

小鼠禁食6 h后，称量体质量并测定空腹血糖，腹腔注射胰岛素溶液（诺和锐，丹麦诺和诺德公司），剂量为0.8 U/kg，检测注射后30、60、90 min小鼠尾静脉微量血糖水平。

4.胰岛素水平检测

参照小鼠超敏胰岛素定量检测试剂盒（酶联免疫法）说明书，往包被微孔（板）中分别加入校准品、质控品和样本，将制备好的酶结合物1×溶液加入以上各孔进行孵育，与3，3，5，5-四甲基联苯胺（TMB）显色反应后加入硫酸终止反应，最后通过酶标仪在450 nm处读取反应的终点。绘制标准曲线算出样本血清胰岛素浓度。

5.胰腺组织胰岛素与4，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）免疫荧光染色

分离胰腺后迅速称量质量，用4%多聚甲醛固定胰腺，石蜡包埋后切片（5 μm）。用豚鼠抗胰岛素一抗（1∶ 200稀释，英国Abcam公司）4℃过夜孵育，然后用带有Rhodamine荧光基团的驴抗豚鼠二抗（1∶ 200，美国Jackson Immuno Research公司）室温孵育2 h，再用DAPI（美国Invitrogen公司）染核。使用Axio Imager Z1正置荧光显微镜（德国Carl Zeiss公司）摄片。

四、统计学处理

采用SPSS 22.0进行数据统计分析，Graph Pad Prism软件作图。符合正态分布的计量资料以±s表示，2组间比较采用独立样本t检验，组内前后比较采用配对t检验，组内前后多个时间点进行对比则先用单组重复测量资料方差分析，差异有统计学意义时再用配对t检验；非正态分布的计量资料采用中位数（上、下四分位数）表示，组间比较采用秩和检验。P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、空腹血糖在高脂饮食诱导肥胖小鼠中的动态变化

基线时，2组小鼠空腹血糖水平无差异[高脂饮食组为（7.86±0.74）mmol/L，对照饮食组为（8.43±0.64）mmol/L，P=0.30]。饮食干预开始后，2组小鼠空腹血糖均呈逐渐上升趋势，高脂饮食组上升更显著。观察第3个月，高脂饮食组血糖达（11.73±0.80）mmol/L，较对照饮食组（9.85±0.44）mmol/L高（P=0.006）。这一具有统计学差异的血糖分离趋势持续至第7个月[高脂饮食组（11.34±1.45）mmol/L，对照饮食组（8.46±0.80）mmol/L，P=0.013]。第8个月高脂饮食组血糖水平下降至（10.03±1.73）mmol/L，而对照饮食组仍维持在8.50 mmol/L左右。此后，高脂饮食组血糖继续逐渐下降，至第12个月为（8.26±1.47）mmol/L，对照饮食组为（7.54±0.14）mmol/L（P=0.91），见图1A。

与空腹血糖的动态变化趋势不同，观察期内小鼠体质量呈持续增长趋势，分为前5个月的快速增长期和后7个月的缓慢增长/平台期。基线时，2组小鼠的体质量比较差异无统计学意义[高脂饮食组（24.99±0.76）g，对照饮食组（25.03±0.84）g，P=0.96]；前5个月中，高脂饮食组小鼠平均体质量增长速度为每个月（5.78±0.64）g，对照饮食组小鼠为每个月（2.50±0.35）g（P<0.001）。期间，在第2个月末2组小鼠体质量比较差异已具有统计学意义[高脂饮食组（36.84±3.44）g，对照饮食组（30.96±1.88）g，P=0.024]。随着观察时间延长，2组体质量分离的趋势加剧。至观察终点，高脂饮食组体质量为（59.90±2.79）g，较对照饮食组的（39.66±5.33）g高（P=0.004），见图1B。

與体质量持续增长趋势不同，2组小鼠的月均摄入热量在第1个月最高，此后逐渐下降，自第4个月始稳定小幅波动直至观察终点。组间比较结果显示，1～8个月2组摄入热量比较差异无统计学意义（P均>0.05），9～10个月，对照饮食组摄入热卡略高于高脂饮食组，比较差异有统计学意义（P均<0.05），见图1C。

A：12个月观察期内小鼠月均血糖；B： 12个月观察期内小鼠月均体质量；C： 12个月观察期内小鼠月均摄食量；与对照饮食组比较，*为P<0.05，#为P<0.01

二、空腹高血糖自发缓解前后糖耐量、胰岛素耐量的比较

观察期第6个月（高脂饮食诱导出空腹高血糖并持续3个月）高脂饮食诱导的肥胖小鼠OGTT曲线下面积、IPITT曲线下面积均较对照饮食组大，且OGTT曲线下面积2组比较差异具有统计学意义（P<0.05），见图2A、B。观察期第11个月为高脂饮食组空腹高血糖自发缓解并持续3个月，此时OGTT结果示高脂饮食组空腹血糖较对照饮食组高，但两者均在正常血糖范围内，分别为（6.07±0.56）mmol/L与（4.88±0.62）mmol/L（P=0.046），其他时间点2组小鼠血糖绝对值、曲线下总面积比较差异均无统计学意义（P均>0.05），见图2C。

IPITT结果显示，对照饮食组小鼠血糖在注射胰岛素后30 min血糖自基线时的（8.00±1.04）mmol/L降至（5.17±1.67）mmol/L，60 min时进一步降至谷值（4.33±1.72）mmol/L，之后略回升；而高脂饮食组小鼠血糖曲线平缓，无显著降幅；2组在注射胰岛素后各时间点血糖下降百分比绝对值及血糖下降百分比曲线下面积变化趋势与观察期第6个月时IPITT相似，见图2D。

进一步比较前后2次OGTT在组内的差异，结果提示对照饮食组各时间点血糖水平及OGTT曲线下面积前后比较无差异。高脂饮食组第11个月OGTT曲线下面积与第6个月比较差异无统计学意义，但经单组重复测量资料方差分析，第11个月时糖负荷后各时间点血糖水平与第6个月时比较差异有统计学意义（F=21.95，P

三、空腹高血糖自发缓解伴随胰岛功能代偿

空腹高血糖自发缓解现象维持至观察终点。观察终点处死小鼠时，2组各有1只小鼠因心脏穿刺采血失败未能获得足够量血清，不纳入血清指标统计分析。比较2组小鼠空腹血清胰岛素水平，高脂饮食组较对照饮食组高（P=0.007），见表1。

胰腺组织切片胰岛素染色显示高脂饮食组胰岛总数、长径超过150 μm或面积大于3 000 μm2的大胰岛比例较对照饮食组的多（分别为40.91%、43.18%；5.88%、5.88%），平均胰岛面积较对照饮食组大（P=0.009，图3A～D），提示胰岛β细胞合成及分泌胰岛素作用增强。

A：胰腺组织胰岛素（Ins红色）与DAPI（蓝色）免疫荧光染色（×200）；B：单个胰岛长短径大小分布（×400，n=3）；C：单个胰岛面积分布（×400，n=3）；D：平均胰岛面积；与对照饮食组比较，#为P<0.01

进一步计算胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）和胰岛素分泌指数（HOMA-β），HOMA-IR结果示高脂饮食组约为对照饮食组的4倍（表1），与观察期第11个月IPITT结果一致，即高脂饮食显著增加胰岛素抵抗水平；而高脂饮食组的HOMA-β也较对照饮食组高，但比较差异无统计学意义，进一步行功效检验，效能为0.09，因此该指标阴性结果可能与本研究样本量较小有关。高脂饮食组小鼠LDL-C较对照饮食组高（P<0.001）。2组血清肌酐、尿素氮比较差异均无统计学意义（P均>0.05），见表2。

讨 论

在本研究中，笔者观察到持续单纯高脂饮食诱导空腹高血糖继之自发缓解并伴随糖耐量改善。这是据笔者所知首次观察到的T2DM自发性缓解的动物模型。此模型具有以下特征，首先，糖代谢异常的自发缓解为完全代偿，不仅表现为空腹高血糖回落，糖负荷后血糖水平亦恢复至对照小鼠水平。此模型中高血糖幅度较低，更为常用的T2DM动物模型是高脂联合高糖饮食干预8～12周，或高脂联合小剂量链脲佐菌素注射以达到更高的空腹血糖水平（15～20 mmol/L），这可能是既往未能在T2DM动物模型中观察到空腹高血糖自发缓解现象的原因。其次，上述代偿的主要机制是胰岛β细胞功能上调，表现为胰岛数目及平均面积增加、血清胰岛素水平显著升高。在这一过程中，胰岛素抵抗的程度无明显改善，主要表现在高脂饮食诱导体质量持续增加，即使在空腹高血糖完全自发缓解后，小鼠体质量仍继续缓慢上升；IPITT数据也提示较空腹高血糖出现时，空腹高血糖缓解时胰岛素敏感性更低。需要指出的是，2次OGTT中，对照饮食小鼠糖负荷后60 min血糖水平亦略高于11.1 mmol/L，达到糖代谢异常的诊断标准。这一现象与C57BL/6J小鼠本身因为调控线粒体质子泵的烟酰胺核苷酸转氢酶（Nnt）突变导致胰岛β细胞受葡萄糖刺激后胰岛素释放障礙有关。即C57BL/6J小鼠本身具有轻度糖耐量异常的遗传特性[7]。最后，本模型中空腹高血糖程度较轻，单次最高空腹血糖未大于14 mmol/L，与在T2DM自发缓解的患者中观察到的基线高血糖程度较轻的现象一致[5]。综上所述，本模型特征是显著肥胖并轻度高血糖，在至少8个月的高脂饮食干预中观察到的胰岛β细胞功能失代偿继之再被完全代偿的主要机制是高脂饮食诱导胰岛β细胞功能上调。

由于单纯高脂饮食诱导的肥胖模型被广泛应用，迄今为止已有较多相关研究。目前认为高脂饮食能诱导胰岛β细胞增殖、肥大及凋亡[8]。雄性C57BL/6J 小鼠中行短程高脂饮食干预可观察到胰岛β细胞质量增加伴随早期胰岛β细胞Ki-67表达上调[9]。其他研究者使用高脂饮食干预4～7 d后即观察到胰岛β细胞Cyclin D2表达上调[10]。这些均提示高脂饮食对调节胰岛β细胞增殖有促进作用。上述研究观察时间相对较短，为高脂饮食的急性作用，小鼠空腹血糖未达11.1 mmol/L。有研究者在雌性小鼠中进行12个月的长程高脂饮食干预并诱导出肥胖表型，同样观察到胰岛质量的增加[11]。但迄今为止，上述肥胖表型与本研究中的空腹高血糖自发缓解表型存在差异，进一步在本模型上观察胰岛β细胞功能的动态变化及调控机制是探讨T2DM自发缓解机制的直接途径。

本研究的局限性包括：为单纯的描述性研究，对小鼠空腹高血糖自发性缓解未行进一步机制探讨，且2组小鼠数目均较少；另外，本模型中血糖仅出现轻度升高，所观察到的自发缓解现象是否适用于血糖更高的模型如高糖高脂诱导的T2DM动物模型等，尚需进一步证实。在此模型上扩大样本量，检测胰岛β细胞的增殖、肥大、凋亡、去分化等病理生理过程的变化，并结合体外实验进行系统的胰岛β细胞功能完全代偿相关机制研究将是笔者进一步的研究方向。

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（收稿日期：2018-01-30）

（本文编辑：洪悦民）