一测多评法同时测定车前子配方颗粒中3种成分含量

田方 李军山 常云凤 高晗 李雪利

摘 要：为实现对车前子配方颗粒多指标成分的质量评价，解决中药化学对照品分离难度大、单体性质不稳定、供应价格高等问题，建立了一测多评法同时测定车前子配方颗粒中的3种有效成分含量。以京尼平苷酸为内标物，建立与芦丁、毛蕊花糖苷的相对校正因子，测定其含量，同时采用外标法测定这3种成分的含量，比较两种方法的结果差异。结果表明：京尼平苷酸、芦丁、毛蕊花糖苷分别在0.804～8.040，0.172～1.720，0.158～1.580 μg范围内线性关系良好（r≥0.999），平均加样回收率分别为102.52%，102.00%和101.86%，RSD值分别为1.64%，1.06%和1.07%。一测多评法所得结果与外标法差异不明显，具有较高的重复性、稳定性及可信度，可为车前子配方颗粒的质量评价提供参考依据。

關键词：中药化学;车前子配方颗粒;京尼平苷酸;芦丁;毛蕊花糖苷;一测多评

中图分类号：R2841   文献标志码：A

Simultaneous determination of three constituents in Plantago

Seed formula granules by QAMS

TIAN Fang1， LI Junshan1，2， CHANG Yunfeng1， GAO Han1， LI Xueli1

（1. Shineway Pharmaceutical Group Company Limited， Shijiazhuang， Hebei 051430， China;2. TCM Formula Granule Engineering Technology Research Center of Hebei， Shijiazhuang， Hebei  050200， China）

Abstract：In order to achieve the quality evaluation of the multi-index components of Plantago Seed Formula Granules and to solve the problem of the difficulty in separating the chemical reference substances of traditional Chinese medicine and the unstable supply price of monomer properties， the quantitative analysis of multi-components by single marker （QAMS） is established to simultaneously determine the content of three effective components in Plantago Seed formula granules.Geniposidic acid is used as the internal reference substance， and the relative correction factor of Rutin and Verbascoside is established respectively， measuring the content， and the three constituents are determined by the relative correction factor. At the same time， the content of the 3 components is determined by external standard method， and the difference between the results of the two methods is compared. Geniposidic acid， Rutin and Verbascoside show good linear relationships within the ranges of 0.804～8.040，0172～1.720，0.158～1.580 μg（r≥0.999），whose average recovery rate is 102.52%，102.00%，101.86%，and the RSD is 164%，1.06%，1.07% correspondingly. The results obtained by QAMS are close to the external standard method. The results turn out that it is no obviously difference between the two Methods and the quantitative analysis of multi-components by single marker （QAMS） is accurate and feasible， which could provide a reference for the quality evaluation of Plantago Seed formula granules.

Keywords：chemistry of Chinese materia medica;Plantago Seed formula granules; Geniposidic acid; Rutin; Verbascoside; quantitative analysis of multi-components by single marker （QAMS）

车前子为车前科植物车前Plantago asiatica L.或平车前Plantago depressa Willd.的干燥成熟种子，性寒，味甘，归肝、肾、肺、小肠经，《神农本草经》将其列为上品，具有清热利尿通淋、渗湿止泻、明目、祛痰的功效，用于治疗热淋涩痛、水肿胀满、暑湿泄泻、目赤肿痛、痰热咳嗽[1]，主产于江西、河南等地。本研究所用样品为车前的干燥成熟种子经水提取、浓缩、喷雾干燥而制成的颗粒，具有免煎易服、携带方便、计量准确、调配方便等优点，受到广大医患人员的欢迎[2]，但关于该制剂的质量控制方法目前尚无统一标准，相关报道也较少。

车前子配方颗粒的临床疗效是其活性成分、药理活性的综合体现，仅以单指标成分评价其质量高低有一定的局限性，难以体现制剂的整体质量。2015年版《中华人民共和国药典》收录了一测多评法测定黄连、丹参等药材成分的含量，很好地解决了中药化学对照品分离难度大、单体性质不稳定、供应价格高等问题，实现了中药多指标的质量评价[3-4]。也有研究人员报道了采用HPLC-DAD，对配方颗粒多种成分实现了中药多指标质量评价[5]。笔者采用一测多评法，测定车前子配方颗粒中京尼平苷酸、芦丁、毛蕊花糖苷的含量，建立了用一种中药化学对照品同时评价3种成分含量的方法，探讨了该方法的可行性与适用性。

1 主要仪器与材料

高效液相色谱仪，日本岛津公司提供;AE 240电子分析天平，瑞士Mettler-Toledo有限公司提供;KH-3200E超声波清洗器，江苏昆山禾创超声仪器有限公司提供。

京尼平苷酸对照品（批号为11828-201604，质量分数为97.4%），芦丁对照品（批号为11630-201607，质量分数为98.2%），毛蕊花糖苷对照品（批号为111530-201512，质量分数为96.7%），均购自中国食品药品检定研究院;车前子配方颗粒，共12批，分别购自神威药业、三九企业集团、江阴天江药业、四川新绿色药业、湖北康仁堂药业、广东一方制药有限公司;乙腈，色谱纯;其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果[STBZ][6-10]

2.1 色谱条件

Waters C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流动相为乙腈-0.5%（体积分数，下同）冰醋酸，检测波长为260 nm，柱温为30 ℃，流速为1 mL/min。流动相梯度洗脱条件见表1，色谱图见图1。

2.2 供试品溶液的制备

取车前子配方颗粒，研细，精密称取0.50 g，置入具塞锥形瓶中，精密加入60%（体积分数，下同）甲醇25 mL，称定质量，超声（250 W，40 kHz）60 min。取出，室温放置，用60%甲醇补足减失的质量，摇匀，过滤，取续滤液，即得。

2.3 对照品溶液的制备

精密称取京尼平苷酸、芦丁、毛蕊花糖苷对照品适量，加入一定量的60%的甲醇，制成0.402，0.086，0.079 mg/mL的对照品溶液。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系考察

精密吸取对照品溶液2，6，10，12，16，20 μL，注入液相色谱仪，以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标进行回归，结果见表2。由表2可知，各成分在各自范围内的线性关系均良好。

2.4.2 精密度试验

精密吸取同一供试品溶液，连续进样6次，测得京尼平苷酸、毛蕊花糖苷、芦丁精密度RSD值分别为0.23%，0.19%和0.28%，表明仪器的精密度良好。仪器精密度测定结果见表3。

2.4.3 稳定性试验

精密吸取同一供试品溶液，于0，2，4，6，10，12，16，18和24 h分别进样，测得京尼平苷酸、毛蕊花糖苷、芦丁峰面积RSD值分别为0.42%，0.34%和0.32%，表明供试品溶液在24 h内的稳定性良好。稳定性考察结果详见表4。

2.4.4 重复性试验

取同一样品，按“2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，测得京尼平苷酸、毛蕊花糖苷、芦丁

峰面积与取样量比值的RSD值分别为0.38%，0.32%和0.27%，表明方法的重复性良好。重复性考察结果见表5。

2.4.5 加样回收率试验

精密称取已知含量的同一样品各0.10 g，共6份，分别按样品含量的80%，100%，120%加入

对照品溶液，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，计算其回收率，结果见表6。

2.5 相对校正因子测定[STBZ][11-15]

2.5.1 计算方法

取混合對照品溶液进样2，6，10，16，20 μL，按公式fk/m=fk/fm=Wk×Am/（Wm×Ak）计算相对校正因子。其中：Ak为内标物峰面积;Wk为内标物浓度;Am为组分m的峰面积;Wm为组分m的浓度。以京尼平苷酸为内标，计算芦丁、毛蕊花糖苷相对校正因子，结果见表7。

2.5.2 耐用性考察

在3种不同厂家高效液相色谱仪和3种不同型号的色谱柱上进行测定，计算平均值，结果见表8;测定在不同柱温、流速下的相对校正因子，结果见表9和表10。

2.5.3 色谱峰定位

利用相对保留时间对待测组分进行定位，考察不同品牌色谱柱的相对保留时间。结果表明，各组分在6种不同品牌色谱柱中的出峰顺序相同，芦丁、毛蕊花糖苷的相对保留时间分别为1.68和1.72，RSD值分别为1.22%和1.41%，表明相对保留时间可以用于色谱峰的定位。

2.5.4 样品含量测定

按“2.2”项下方法制备12批车前子配方颗粒供试品溶液，并按“2.1”项下色谱条件分别采用外标法和一测多评法进行测定，结果如表11所示。由表11可知，2种方法所得结果差异不明显（RSD值<3.0%），表明一测多评法与外标法测定结果无明显差异。

3 討 论

3.1 检测波长的选择

采用DAD检测器对供试品溶液进行全波长扫描，紫外光谱图见图2。研究发现，京尼平苷酸、芦丁、毛蕊花糖苷的最大吸收波长分别为238，255，328 nm。综合考虑色谱图的基线、分离度、数目及峰面积，最终选择检测波长为260 nm。

3.2 供试品溶液制备方法选择

对供试品的提取溶剂（25%甲醇、60%甲醇、80%甲醇、甲醇、水）和超声时间（10，30，60 min）进行比较，发现采用60%甲醇超声60 min时，各成分的提取效率较高，色谱图的峰型较好。

3.3 内标物的选择

京尼平苷酸、芦丁、毛蕊花糖苷在车前子配方颗粒中的含量较高，由于京尼平苷酸化学性质稳定，且2015版《中华人民共和国药典》将其作为车前子药材质量优劣的评价指标，故选择京尼平苷酸作为内标物。

4 结 论

1）目前中药化学标准品的数量和种类仍不能满足质量检测的需要，实际应用中常采用分别检测有效成分的方法来控制中药及其制剂的质量，检测效率较低，检测成本偏高。一测多评法利用中药中各成分间的相对校正因子同时测定多个有效成分，实现了在对照品缺乏的情况下进行中药多成分的质量控制，显著降低了检测成本，提高了工作效率，对于中药及其制剂的研究与开发具有重要意义。

2）以车前子配方颗粒为研究对象，通过方法学考察、相对校正因子确认、耐用性考察、色谱峰定位等过程，对一测多评方法的可行性与适用性进行了探讨，所得结果与外标法差异不明显，具有较高的重复性、稳定性及可信度，可为车前子配方颗粒的质量评价提供参考依据。

3）笔者仅对6个生产厂家12批次的配方颗粒进行了研究，对于更多批次和其他厂家的数据有待进一步加以研究;此外，对于不同产地的车前子制成的配方颗粒的相对校正因子、相对保留时间也未进行考察。针对以上不足，一测多评法测定车前子配方颗粒中多种成分含量的相关研究需要进一步对药材的产地和批次进行考察，以明确方法的普遍适用性。

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