坏损外担菌改良培养基筛选

李继业 赵晨心 彭丽娟

摘 要：坏损外担菌（Exobasidium vexans）在PDA培养基上生长十分缓慢，影响后续研究。为筛选促进坏损外担菌（E.vexans）生长的改良培养基。本文在PDA培养基中添加常用的4种碳源和4种氮源，配制16种培养基，初步确定培养坏损外担菌（E.vexans）适宜的碳、氮源组合。再用正交试验，确定碳、氮源用量与比例。结果显示：碳源对坏损外担菌（E.vexans）生长的影响大于氮源;有机氮比无机氮更适合其生长;最佳碳源、氮源为蔗糖+酵母粉，理论最佳培养基配方为酵母粉12 g/L、马铃薯150 g/L、蔗糖25 g/L。与PDA培养基比较，该菌在最佳培养基上生长速率快，菌丝更饱满。

关键词：茶饼病菌;正交试验;培养基改良

中图分类号：Q935

文献标识码：A

文章编号：1008-0457（2018）06-0020-06 国际DOI编码：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2018.06.004

由坏损外担菌（Exobasidium vexans）引起的茶饼病，主要危害茶树（Camellia sinensis）的芽和叶，我国四大茶区均有分布。发病后叶片制成的茶叶，味道变差、叶片容易碎裂，品质明显下降[1]。发病时会在寄主叶片背部产生附着白色粉状物质的病斑，即为病原菌子实层，是由担子、担孢子聚集着生而成[2-4]。刘爱英等人[5]研究显示，引起油茶饼病的细丽外担菌（Exobasidium gracile）次生代谢产物中含有多种植物生长调节物质，对植物生长和发育有刺激作用;细丽外担菌（E.gracile）与坏损外担菌（E.vexans）属于同属亲缘关系相近的种，具有潜在产生长调节剂的能力。对植物而言，植物生长调节剂不仅可以调控植物体内核酸、酶以及蛋白质的合成，还能对植物生长发育过程中的不同阶段，如发芽、生根、细胞生长、器官分化、花芽分化、开花、结果、落叶、休眠等起到调节和控制作用[6-8]。如通过人工培养真菌获得大量的对植物生长起到调节作用的次生代謝产物，可大大降低大田施用生长调节物质的成本和减少对环境的污染[9-11]。目前国内针对这类真菌的研究不多，本文通过在PDA培养基中添加不同碳、氮源，找出适合坏损外担菌（E.vexans）生长的改良PDA培养基。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

坏损外担菌（E.vexans）由贵州大学农学院植物病理学实验室分离、鉴定和保存[12]。

1.2 方法

先通过穷举法找到最适碳源、氮源，然后结合正交法确定理论最佳培养基配比，最后按照理论最佳培养基制作改良培养基进行验证。

1.2.1 穷举法筛选病原菌生长最佳营养物质

选择常用的4种碳源和4种氮源，使用穷举法，配制时分别选择1种碳源和1种氮源，制成16种不同的培养基，剂量为制备真菌培养基常用剂量（见表1）。将坏损外担菌（E.vexans）打成6 mm大小的菌饼，分别接种到16种配方的培养基平板上，置于28℃培养箱中培养。每种配方为1个处理，每处理重复4次。对照培养基为PDA。测量每处理菌落平均直径，每3 d测量1次。参考16种培养基上坏损外担菌（E.vexans）生长15 d后的菌丝形态，菌丝色泽，菌丝密度，得到最优培养基营养物质配方[13-14]。

1.2.2 正交试验筛选最优碳氮源用量

PDA培养基中马铃薯浸出物不仅提供了碳源与氮源，还含有重要的微量营养成分，故将其用量作为改良培养基的一个因素来处理[15]。根据1.2.1粗筛选好的最优配方（为酵母粉+马铃薯+蔗糖），设计正交试验探索不同用量、不同比例的营养物质对微生物生长的影响[16-17]。此正交试验为3因素5水平，考虑采用一部分L25（56）正交表（使用SPSS软件进行正交试验设计），共设计25个处理（见表2，表3）。将坏损外担菌（E.vexans）在PD液体培养基中震荡培养5～7 d（转速150 r/min，28℃），制成培养液，用移液器在不同处理的平板上加入1 μL菌液，每个处理重复4次，培养15 d后测量菌落直径。

2 结果与分析

2.1 坏损外担菌（E.vexans）菌落平均直径

坏损外担菌（E.vexans）在16种不同培养基上生长状况见表4。坏损外担菌（E.vexans）在第9 d时开始在5种培养基开始生长，在第15 d时菌落直径最大的培养基是A2B1，即碳源为蔗糖，氮源为酵母粉的组合。不同碳源组在15 d时菌落平均直径大小依次为：A2 > A3 > A1 > A4，可见A2（蔗糖）对其生长最为有利（表5）;不同氮源组在15 d时菌落平均直径大小依次为：B1 > B4 > B3 > B2，可见B1（酵母粉）对其菌落生长最为有利（表6）。

2.2 坏损外担菌（E.vexans）生长状况

对坏损外担菌（E.vexans）16种培养基上生长状况见表7。在A1B1中菌落形态完整，菌丝色泽洁白，菌丝不密集;在A1B2中菌丝完整，菌丝色泽呈现米白色，菌丝不密集;在A1B3中菌丝形态完整，菌丝色泽呈米黄色，菌丝密度一般;在A1B4中菌落形态较完整，菌丝色泽呈米黄色，菌丝密度较高，在A2B1中菌落形态十分完整，菌丝色泽呈米黄色，菌丝密度极高;在A2B2中菌丝形态较完整，菌丝色泽洁白，菌丝密度较密;在A2B3中菌落形态完整，菌丝色泽呈米黄色，菌丝密度一般;在A2B4中菌丝形态完整，菌丝色泽呈米黄色，菌丝密度一般;在A3B1中菌丝形态完整，菌丝色泽呈米黄色，菌丝不密集;在A3B2中菌丝形态完整，菌丝色泽呈米黄色，菌丝较为密集;在A3B3中菌丝形态完整，菌丝色泽呈米黄色，在A3B4中菌丝形态不完整，菌丝色泽呈米黄色，菌丝不密集。在A4B1中菌丝形态完整菌丝色泽呈洁白，菌丝密度较高;A4B2菌丝形态较为完整色泽米黄色，菌丝密度一般;A4B3菌丝形态较为完整色泽米黄色，菌丝密度一般;A4B4菌丝形态较为完整色泽米黄色，菌丝不密集。

经比较，A2B1培养基（碳源为蔗糖，氮源为酵母粉）上坏损外担菌（E.vexans）菌丝密度最高。

2.3 不同配比碳氮源正交试验结果

对正交试验的结果（表8）用IBM SPSS Statistics 19软件进行方差分析 （见表9）。P蔗糖=0.010≤0.01，P酵母=0.033≤0.05，P马铃薯=0.124>0.05，故蔗糖用量对菌落直径的影响极显著，酵母对菌落直径的影响显著，马铃薯对其影响不显著。

正交试验极差RC>RA> RB（见表8），3因素对坏损外担菌（E.vexans）生长的影响从大到小依次为蔗糖 > 酵母 > 马铃薯。实验中最佳组合为A2B2C3，菌落平均直径为2.85 cm，其次为A4B5C3，菌落平均直径为2.6 cm，二者比较接近。通过计算K值并比较，理论最佳水平组合为 A4B2C3。

按照理论最佳水平组合配制培养基（酵母12 g/L、马铃薯150 g/L、蔗糖25 g/L），相同条件下，理論最佳水平组合与实验最佳组合培养基平板上加入1 μL菌液，每处理重复4次。培养15 d后测菌落直径，菌落平均直径分别为2.90 cm和2.85 cm，理论最佳水平组合菌落直径略大于实验最佳组合，但相差不大。故最佳培养基配方为：酵母12 g/L、马铃薯150 g/L、蔗糖25 g/L。

3 结论与讨论

本文使用穷举法，选择葡萄糖、蔗糖、乳糖和果糖4种碳源，酵母粉、硫酸铵、硝酸铵和蛋白胨4种氮源，通过观察坏损外担菌（E.vexans）在16种不同培养基上菌落直径和菌丝形态，得到最适合坏损外担菌（E.vexans）生长的营养物质组合为蔗糖和酵母粉。通过正交试验，确定适宜该菌生长的碳源、氮源配比。

正交试验结果显示：蔗糖用量对菌落直径的影响极显著，酵母对菌落直径的影响显著，马铃薯对其影响不显著;影响菌落生长的因素中，从大到小依次为蔗糖>酵母粉>马铃薯。在闫鸿媛[18]的研究中，常规食用菌培养碳源为主料，氮源为辅料，本实验结果与其结果相符。方差分析结果显示，马铃薯用量对菌落直径没有显著性影响，推测是添加碳源和氮源在一定程度上削弱了马铃薯在改良培养基中的地位，但马铃薯在改良培养基中应继续使用。因此，最佳培养基配方为蔗糖25 g/L、酵母12 g/L、马铃薯150 g/L。

本实验还进行了理论最佳培养基和实验组最佳培养基的对比，结果显示：理论最佳培养基A4B2C3略优于实验组最佳培养基A2B2C3，差别非常小，菌落直径平均数仅相差0.05 cm。考虑到理论最佳培养基配方中酵母粉用量是实验组最佳培养基的2倍，若大规模培养，实验组最佳培养基A2B2C3更节约成本，即蔗糖25 g/L、酵母6 g/L、马铃薯150 g/L。

碳源是微生物培养基中重要的营养成分之一，是微生物代谢及生长的重要能量物质来源。不同种类的碳源组成的培养基对坏损外担菌（E.vexans）的生长速率有着不同的影响。潘武等[19]研究表明，碳源为蔗糖的培养基能够促进稻曲病病原菌（Ustilaginoidea oryzae）的生长[18]。本文选用的4种碳源，坏损外担菌（E.vexans）均可以利用，而蔗糖更利于菌丝生长和菌落扩大，与葡萄糖相比，蔗糖是促进部分真菌生长更好的碳源。正交试验结果表明，碳源对其生长的影响大于氮源对其生长的影响。

微生物生长和繁殖过程中，氮源也是不可或缺的，用于合成核酸和蛋白质等物质。本实验对有机氮和无机氮都进行了探索。坏损外担菌（E.vexans）对有机氮与无机氮均可利用。A4组培养基为在PDA中添加了不同氮源，结果显示，相同培养时间内菌落直径均明显大于对照（PDA培养基），表明添加氮源可促进其生长（见表4处理13～17）。不同氮源对坏损外担菌（E.vexans）菌落生长影响不一样，在碳源相同的同组实验中比较15 d时菌落平均直径和菌丝密度，酵母粉和蛋白胨这2种有机氮源对坏损外担菌（E.vexans）菌落生长影响高于无机氮源，含有机氮源的培养基中菌丝生长更为迅速（见表6）;2种无机氮源，坏损外担菌（E.vexans）生长速率硫酸铵高于硝酸铵。

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