自发性高血压大鼠左心室肥厚的蛋白质谱研究

刘培 肖隋熙 罗颖 陈偶英 刘天洋 郭心鸽 谭元生 简维雄

〔摘要〕 目的 研究自发性高血压大鼠（spontaneously hypertensive rats，SHR）左心室肥厚心肌组织的蛋白质变化。方法 对8只SHR与8只WKY大鼠组织蛋白质进行iTRAQ检测分析；通过对差异蛋白Pathway富集分析选择与通路相关的蛋白质。结果 筛选出与通路相关的40个差异蛋白，SHR与WKY比较上调的差异蛋白有：1主要组织相容性复合物、2血小板活化因子乙酰水解酶、3有丝分裂原蛋白激酶、4热休克27kDa蛋白、5 Ighg3、6 14-3-3γ蛋白、7纤维蛋白原、8蛋白酶体26S、9纤维蛋白原γ链、10中性胆固醇酯水解酶、11溶血PAF乙酰转移酶、12纤连蛋白。下调的差异蛋白有：13丝氨酸蛋白酶、14载脂蛋白H、15血清锌α2糖蛋白、16泛醌9、17泛醌7、18α2-AP、19激肽原、20肝素2、21未知蛋白、22钠钾ATP转移酶、23胶原蛋白、24集聚蛋白、25对羟基苯丙酮酸双氧化酶、26C反应蛋白、27整合素、28凝血因子Ⅻ、29胎球蛋白、30整合素α7、31碳酸酐酶、32CD36、33免疫球蛋白重链γ多肽、34转胶蛋白、35血红蛋白-α。结论 SHR左心室肥厚发生涉及心肌凋亡、细胞增殖增生、炎症等多种细胞因子，导致细胞损伤与保护作用失衡。

〔关键词〕 自发性高血压大鼠；左心室肥厚；蛋白质组学

〔中图分类号〕R544.1；R393 〔文献标志码〕A 〔文章编号〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2018.06.001

〔Abstract〕 Objective To study the protein changes in the myocardium of left ventricular hypertrophy in spontaneously hypertensive rats （SHR）. Methods The protein of 8 SHR and 8 WKY rats were detected and analyzed by iTRAQ detection and analysis technique. The proteins related to pathway were selected by enrichment analysis of differential protein pathway. Results The 40 differential proteins related to pathways were screened. Upregulated proteins in SHR compared with WKY： 1 major histocompatibility complex， 2 platelet activating factor acetylhydrolase， 3 mitogen activated protein kinase， 4 heat shock protein 27 kDa， 5 Ighg 3， 6 14-3-3 protein gamma， 7 ibrinogen， 8 fibrin and 26 S proteasome， 9 the original gamol/La chain， 10 neutral cholesteryl ester hydrolase， 11 hemolytic PAF acetyltransferase， 12 fibronectin. Down regulated differentially proteins： 13 serine protease， 14 apolipoprotein H， 15 serum zinc alpha 2 glycoprotein， 16 ubiquinone 9， 17 ubiquinone 7， 18 alpha 2-AP， 19 kininogen， 20 heparin cofactor 2， 21 unknown protein， 22 sodium-potassium ATP transferase， 23 collagen， 24 agrin， 25 concentration of HPPD， 26 C reactive protein， 27 integrin， 28 coagulation factor XII， 29 fetuin 30 integrin alpha 7， 31 carbonic anhydrase， 32 CD36， 33 immune globulin heavy chain gamma polypeptide， 34 transgelin， 35 hemoglobin alpha. Conclusion Left ventricular hypertrophy in SHR involves many kinds of cytokines， such as myocardial apoptosis， cell proliferation， proliferation， inflamol / Lation and so on， leading to the imbalance of cell injury and protection.

〔Keywords〕 spontaneously hypertensive rats； left ventricular hypertrophy； proteomics

自發性高血压大鼠（spontaneously hypertensive rats，SHR）是研究高血压疾病的经典鼠种，研究发现在第14周龄时，SHR的左心室质量和左心室质量指数已经显著高于对照组，说明此时左室肥厚已经基本形成[1]。人体和各种生命物质是由蛋白质组成的，为了从整体角度分析左室肥厚时细胞内生命过程中动态变化的蛋白质组成、表达水平、修饰状况、蛋白质之间以及蛋白质与其它生物分子之间的相互作用。本项目应用相对和绝对定量同位素标记（iTRAQ）技术展开对左心室肥厚干预的蛋白质组学研究。

1 材料

1.1 动物

选用SPF级12周龄自发性高血压大鼠（SHR） 8只，雄性，同龄血压正常的（wistar-kyoto，WKY）大鼠8只，雄性，质量180～220 g，大鼠及饲料均由湖南中医药大学动物实验中心提供（SHR大鼠购自北京维通利华实验动物技術有限公司，动物合格编号：20141020，饲料购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司），饲养环境温度（20.0±2.0） ℃，相对湿度45%～70%。自由饮食饮水，早8点至下午5点自动灯光照明。

1.2 试剂

Trypsin（Promega公司，美国），三乙胺碳酸氢盐（Applied Biosystem公司，意大利），TEAB（Applied Biosystem公司，意大利），乙腈（Sigma公司，美国），甲酸（Sigma公司，美国），2-D Quant Kit（GE Healthcare公司，美国），8标iTRAQ试剂（Applied Biosystem公司，意大利）。

1.3 仪器

离心机（德国，Eppendorf公司），Milli-Q Advantage超纯水系统（美国，密理博），precellys24多功能生物样品均质器（法国，Bertin），VCX130超声波细胞粉碎机（美国，Sonics），Mini-PROTEAN Tetra Cell小型垂直电泳槽（美国，伯乐），powerlook2100xl 扫描仪（美国，UMAX），iMark酶联免疫吸附仪（美国，伯乐），SCX强阳离子交换液相色谱柱（美国，菲罗门公司），LC-20AD nanoHPLCOnline HPLC（日本，岛津公司），C-20AB HPLCOffline HPLC（日本，岛津公司），Q EXACTIVE质谱仪（中国，赛默飞世），Q-EXACTIVE （ThermoFisher Scientific，San Jose，CA）。

2 方法

2.1 蛋白制剂

2组大鼠处死后，分别剪取心脏左心室部分，每个样本剪碎后称取30 mg，用Lysis Buffer含有1 mol/L PMSF和2 mol/L的EDTA（终浓度）萃取。5 min后，10 mol/L DTT（终浓度）加入到样品中。将悬浮液进行超声处理，在200 W15 min，然后在4 ℃，30 000 g离心15 min，上清充分混合，上清加入5倍体积预冷丙酮，在-20摄氏度沉淀2 h，离心在4 ℃下，30 000 g后，弃去上清液。将沉淀物用冷冻丙酮3次。将沉淀风干，溶解于裂解缓冲液。将悬浮液进行超声处理，在200 W15 min，并在4 ℃，30 000 g离心15 min。将上清转移到另一管中。上清液在56摄氏度条件下加入终浓度10 m MDTT处理1 h，还原打开二硫键。随后，加入55 mol/L IAM（终浓度）进行半胱氨酸的烷基化封闭，在暗室孵育1 h。上清充分混合，用5倍体积冷却的丙酮2 h在-20 ℃以沉淀蛋白质。在4 ℃下，30 000 g离心 后，弃去上清液，将沉淀物风干5 min，溶解在500 μL的0.5 mol/L的三乙胺碳酸氢盐中（Applied Biosystems，米兰，意大利），并超声处理在200 W 15 min。最后，将样品在4 ℃，30 000 g离心15 min。将上清液转移到新管中并定量。上清液中的蛋白质被保存在-80 ℃用于进一步分析。

2.2 分离部分iTRAQ标记和SCX分级

每个样品精确取出100 μg蛋白，然后按蛋白∶酶=30∶1的比例加入Trypsin，37 ℃酶解4 h。按上述比例再补加Trypsin1次，37 ℃继续酶解16 h。

胰酶消化后，肽通过真空离心干燥。样品标记用的iTRAQ标签如下：SHR（115标记），WKY组（113标记）。将肽标记的同量异序标记，在室温下孵育2 h。将标记后的各组肽段混合，用SCX柱进行液相分离。

采用岛津LC-20AB液相系统、分离柱为4.6 mm×250 mm型号的UltremexSCX柱对样品进行液相分离。将标记后抽干的混合肽段用4 mL bufferA（25 mol/L NaH2PO4 in 25%ACN，pH2.7）复溶。进柱后以1 mL/min的速率进行梯度洗脱：先在5% buffer B（25 mol/L NaH2PO4，1 mol/L KCl in 25%ACN，pH2.7）中洗脱7 min，紧跟着一个20 min的直线梯度使buffer B由5%上升至60%，最后在2 min内使buffer B的比例上升至100%并保持1 min，然后恢复到5%平衡10 min。整个洗脱过程在214 nm吸光度下进行监测，经过筛选得到12个组分。每个组分分别用StrataX除盐柱除盐，然后冷冻抽干。

2.3 质谱鉴定

将抽干的每个组分分别用buffer A（2% ACN，0.1% FA）复溶至约0.5 μg/μL的浓度，20 000 g离心10 min，除去不溶物质。每个组分上样10 μL（约5 μg蛋白），通过岛津公司LC-20AD型号的纳升液相色谱仪进行分离。所用的柱子柱包括Trap柱和分析柱两部分。分离程序如下：先以8 μL/min的流速在4 min内将样品loading到Trap柱上，紧接着一个总流速为300 nL/min的分析梯度将样品带入分析柱，分离并传输至质谱系统。先在2% bufferB（98% ACN，0.1% FA）下洗脱5 min，跟着一个35 min的线性梯度使bufferB的比例由2%上升至35%，在接下来的5 min内提高到60%，然后在2 min内buffer B增加到80%并保持4 min，最后在1 min内恢复至5%并在此条件下平衡10 min。

经过液相分离的肽段进入到串联ESI质谱仪：Q-EXACTIVE（ThermoFisher Scientific，San Jose， CA）。一级质谱分辨率设置为70 000，二级分辨率为17 500。在母离子中挑选电荷为2+～5+，峰强度超过20 000的15个母离子进行二级分析，用碰撞能量为（27±12）%的HCD模式对肽段进行碎裂，碎片在Orbi中检测，动态排除时间设定为：色谱半峰宽时长。离子源电压设置为1.6 kV。AGC通过orbi来实现，其设置为：一级3E6到二级1E5。扫描的质荷比范围为一级350～2 000，二级100～1 800。

2.4 蛋白质分析方法

2.4.1 数据库选择 Uniprot Rattus（36508sequences）。

2.4.2 Mascot搜索 采用Mascot 2.3.02版本，操作时以mgf文件为原始文件，选择已经建立好的数据库，然后进行数据库搜索。

2.4.3 蛋白质丰度比分布 在相对定量时，如果同一个蛋白质的量在两个样品间没有显著的变化，那么其蛋白质丰度比接近于1。当蛋白的丰度比即差异倍数达到1.2倍以上，且经统计检验其p-value值小于0.05时，视该蛋白为不同样品间的差异蛋白。对每个蛋白质差异倍数以2为底取对数后作出分布如图1。表达量上调的蛋白居于横坐标0位置的右侧，表达量下调的蛋白居于横坐标0位置的左侧。

2.4.4 差异蛋白的Pathway富集分析 Pathway显著性富集分析方法同GO功能富集分析，是以KEGG Pathway为单位，应用超几何检验，找出与所有鉴定到蛋白背景相比，在差异蛋白中显著性富集的Pathway。通过Pathway显著性富集能确定差异蛋白参与的最主要生化代谢途径和信号转导途径。

3 结果

3.1 肽段匹配误差分布

Q-Exactive质谱仪的一级质谱和二级质谱质量精确度都小于2 ppm。但为了防止遗漏鉴定结果，因此基于数据库搜索策略的肽段匹配误差控制在0.02 Da以下。图1显示了所有匹配到的肽段的相对分子量的真实值与理论值之间的误差分布。

3.2 蛋白质鉴定

3.2.1 基本鉴定信息 二级谱图总数（TotalSpectra）344 342，为匹配到的谱图数量（Spectra）82 990，为匹配到特有肽段的谱图数量（UniqueSpectra）69 574，鉴定到特有肽段序列的数量（UniquePeptide）11 135，鉴定到的蛋白质数量（Protein）2 783。

3.2.2 差异蛋白质定量信息统计 在相对定量时，如果同一个蛋白质的量在两个样品间没有显著的变化，那么其蛋白质丰度比接近于1。当蛋白的丰度比即差异倍数达到1.2倍以上，且经统计检验其P<0.05时，视该蛋白为不同样品间的差异蛋白。差异结果表明SHR组与WKY组比较两组共有183个蛋白达相差1.2倍以上，其中68个上调，115个下调。

3.3 差异蛋白的Pathway富集分析

3.3.1 富集Pathway 见表1。

3.3.2 富集Pathway蛋白質 见表2。

4 讨论

心肌肥厚是一个因子、多途径的作用的结果，单一蛋白的改变是可以导致心肌肥厚，但是多个蛋白失衡的交互作用，可能是关键性要素，为此本项目在筛选出差异蛋白后，结合蛋白的Pathway通路，从多个蛋白角度出发，试图从整体性层面的失衡来解释SHR左心室肥厚的机理及其药物干预的机制。为此是以KEGG Pathway为单位，应用超几何检验，找出与所有鉴定到蛋白背景相比，在差异蛋白中显著性富集的Pathway。通过Pathway显著性富集能确定差异蛋白参与的最主要生化代谢途径和信号转导途径。本项目通过Pathway富集分析筛选出：SHR与WKY比较上调的差异蛋白有：1主要组织相容性复合物、2血小板活化因子乙酰水解酶、3有丝分裂原蛋白激酶、4热休克27 kDa蛋白、5 Ighg3、6 14-3-3γ蛋白、7纤维蛋白原、8蛋白酶体26S、9纤维蛋白原γ链、10中性胆固醇酯水解酶、11溶血PAF乙酰转移酶、12纤连蛋白。下调的差异蛋白有：13丝氨酸蛋白酶、14载脂蛋白H、15血清锌α2糖蛋白、16泛醌9、17泛醌7、18α2-AP、19激肽原、20肝素2、21未知蛋白、22钠钾ATP转移酶、23胶原蛋白、24集聚蛋白、25对羟基苯丙酮酸双氧化酶、26C反应蛋白、27整合素、28凝血因子Ⅻ、29激肽原、30整合素α7、31碳酸酐酶、32CD36、33免疫球蛋白重链γ多肽、34转胶蛋白、35血红蛋白-α。

4.1 上调蛋白质意义

主要组织相容性复合物（MHC）的功能是以其产物提呈抗原肽而激活T淋巴细胞，与T细胞表面的T细胞受体结合，实现对抗原和MHC分子的双重识别。在缺血、缺氧、炎症反应等刺激影响下MHC分子表达上调，可被各种炎性因子激活而发挥作用[2]。炎症反应介导了高血压病左心室肥厚已经是研究者的共识。

血小板活化因子乙酰水解酶（PAF-AH）具有水解血小板活化因子和相关磷脂片段并使之失活的作用。血小板活化因子（PAF）能促使血小板和中性粒细胞聚集；促使多种细胞使之产生趋化性及化学激动；参与呼吸暴发和超氧化物的形成、蛋白质的磷酸化；作用于蛋白激酶C（PKC）、花生四烯酸及磷酸肌醇的代谢；促使糖原的分解；促使肿瘤坏死因子的产生；调节白介素的分泌、TIMP-1，具有触发和放大炎症的作用[3]。PAF在生物体内在溶血PAF乙酰转移酶、与PAF乙酞水解酶（LPCAT）作用下以动态形式存在，细胞受到刺激时生成，随后很快被代谢消除。PAF的代谢失活是由PAF乙酞水解酶水解。溶血PAF乙酰转移酶具有将PAF水解片段，合成PAF的作用[4]。我们推测这个两个酶水平上调显示血小板活化因子体系处于激活状态。

丝裂原活化蛋白激酶3（MKK3）是p38 MAPK的上游激活分子，能够特异性激活p38MAPK。p38 MAPK信号通路除了参与基因转录调控外，p38MAPK还参与细胞凋亡、细胞因子生成、细胞骨架重构等生物事件发挥其重要作用，被认为是细胞信息传递的交汇点和共同通路。在正常生理状态下细胞的生长和增殖中有重要作用，在病理性因素刺激引起的心肌细胞肥大的信号转导中也起到重要作用[5]。

热休克蛋白27是小热休克蛋白家族中最具代表性的成员，其水平的增高，是否是心肌细胞肥大时的代偿作用，有学者的研究证实了这一点。在运动诱导的生理性心肌肥厚模型中，HSF1和热休克蛋白如Hsp27和Hsp70的表达明显上调。国内也有学者证实心脏特异性高表达Hsp27具有的诱导小鼠心肌肥厚的作用，ERKs的激活可能是其中的重要分子通路[6]。

IgG中重链CH3功能区，具有结合组织细胞的作用。IgG是属于抗体，表明各种损伤因素增加，导致心肌细胞损伤。

14-3-3是一个调节蛋白家族，能与Raf-1，PKC，细胞分裂周期蛋白25同源蛋白C（Cdc25C），Ras激酶抑制因子（KSR），Bcr，Ca2+/CaM激酶，Bad和跨膜蛋白受体等多种信号蛋白结合， 说明14-3-3蛋白在信号转导过程中发挥重要作用。而以上这些蛋白在心肌肥厚的过程中发挥着重要的作用[7]。

纤维蛋白原（fibrinogen，Fg）在分子结构上包含三条多肽链：Aα、Bβ和γ，分别被纤维蛋白原α（FGA）、纤维蛋白原β（FGB）和纤维蛋白原γ（FGG）三种独立基因所编码。近来的研究表明纤维蛋白原β链的合成是Fg合成的限速步骤。虽在肝细胞内合成，但也可在上皮细胞和成纤维细胞等合成，并与纤维黏连蛋白、层黏连蛋白、透明质酸等协同构成细胞外基质，并通过细胞间黏附分子-1介导的P38、ERK及JNK通路导致心肌细胞异常增生[8]。心肌细胞外基质（ECM）由胶原、纤粘连蛋白、层粘连蛋白及弹性蛋白、蛋白聚糖等组成，其中主要成分是胶原。Ⅰ型胶原占胶原总量的85%，有较大的张力，伸展回弹性小，主要聚合成粗纤维网[9-10]。过量的胶原沉积在心肌间质，可使胶原网络增粗变密，心室被动回弹性下降、心壁硬度增大，心肌顺应性下降，从而导致心脏舒张功能障碍。不同原因所致的间质重构，胶原纤维的变化不同。压力超负荷性左室肥大时，心肌间质胶原合成增加。但心肌缺血或缺血再灌注时心肌胶原纤维出现断裂，含量减少。压力负荷过重导致的左心室肥厚中初期质胶原合成增加，而在第4周时肌胶原纤维量减少[11]。

蛋白酶体可分为20S蛋白酶体和26S蛋白酶体两种形式，细胞内最普遍存在的蛋白酶体是26S蛋白酶体，它是一种包含有1个20S核心颗粒和2个19S调节颗粒的桶状结构，也是一种依赖ATP的蛋白水解复合体尽管蛋白酶体在心肌肥厚中的具体作用有待研究，但在一些心肌肥厚的模型中检测出了蛋白酶体亚单位蛋白质表达的增强，这是因为蛋白酶体促进了心肌肥厚的抑制因子的降解，如早期诱导环腺苷酸抑制因子。此外蛋白酶体还参与了蛋白质降解、修改延长因子的活动等机制[12]。

中性胆固醇酯水解酶1（nCEHs），在中性PH环境下，催化胆固醇酯（CE）水解作用的酶有多种，被称为中性胆固醇酯水解酶。不仅可以清除已蓄积于泡沫细胞中的CE，而且能够防止CE的积聚。nCEHs可不同程度的影响炎症CD40-CD40L系統，从而参与炎症反应过程，与心室重构有着密切的关系[13]。

纤连蛋白（fibronectin，Fn）作为细胞外基质（ECM）中重要的黏附分子之一，通过与细胞膜上的整合素受体（avβ3，avβ1，avβ5，α4β1，α9 β1）结合，从而刺激P38 MAPK下在促进心肌细胞黏附、迁移、增殖等过程中发挥着重要作用[14-15]。

4.2 下调蛋白质意义

血清锌α2糖蛋白（ZAG）对目前的热点如瘦素，脂联素（APN）等脂肪因子有强烈的调节作用，能够上调脂联素的表达[16]。而APN通过抑制细胞外调节蛋白激酶（ERK）信号通路，激活磷酸腺苷活性蛋白酶（AMPK）抑制心肌细胞的肥大[17]。

激肽原1（HKa）是激肽释放酶-激肽系统中的成员之一，作用极其复杂。已经肯定的功效是增强机体的血管舒张能力，促进免疫炎症反应。被证实具有抗粘附特性，HKa能够与带负电荷物质表面上的粘附蛋白结合并将其置换出来；HKa能竞争性抑制纤维蛋白原和体外连接蛋白（VN）等粘附蛋白与细胞表面结合；HKa能抑制细胞粘附到蛋白包被的表面上。激肽释放酶-激肽系统（KKS）具有强大的心血管保护作用，通过抑制JNK/P38MAPK的磷酸化，抑制NF-KB-DNA结合活性后，抑制了MCP-1，VCAM-1从损伤部位的释放，抑制心肌肥厚的形成的作用[18]。

近年来大量研究显示，载脂蛋白H及其抗体与动脉样硬化和体内血栓形成血压增高有较大的相关性。有研究发现载脂蛋白H沉积在缺血性心肌病心肌中而在其他病变心肌样本中没有发现的沉积。推测存在心肌中的载脂蛋白H与炎症过程有关[19]，进一步研究发现载脂蛋白H可以调节腺苷酸环化酶的活力，而腺苷酸环化酶具有心肌细胞的保护作用[20]，抑制心肌肥厚。

α2-AP中α-2 抗纤溶酶是纤维蛋白溶解酶的重要抑制因子，其表达的下调可导致活化的纤维蛋白溶解酶含量增高，而后者则会改变ECM的完整性，从而影响纤维化的发生，在一项肝纤维化的研究中发现肝纤维化组织中α2-AP 水平含量降低，而经干预后肝纤维化程度降低后，α2-AP水平上调。心室肥厚也存在心肌纤维化，α2-AP也可能呈现下调趋势[21]。

肝素2是丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族之一，是存在于体内外的另外一种主要的抗凝血酶物质，还参与炎症反应过程，可以被中性粒细胞释放的弹性蛋白酶水解，释放出来的N端多肽片段对中性粒细胞和单核细胞具有趋化作用，在肺内的作用可能是防止肺内纤维蛋白的沉积的作用[21-22]。在心室肥厚中水平下调可能是炎症过程中分解的结果。

凝血因子Ⅶ （FXII）是肝脏合成的一种丝氨酸蛋白酶，是凝血接触途径的重要组成因子，在高分子量激肽（HK）和血浆激肽释放酶（PK）共同参与下激活内源性凝血途径[23]。还具有促炎症作用，主要通过诱导中性粒细胞聚集和脱颗粒，以及面通过高分子量激肤（HK）生成缓激肽，进一步增强血管壁通透性等功能。在心室肥厚的作用有待进一步探索。

对羟基苯丙酮酸双氧化酶（HPPD）是近年来在除草剂靶标探索中发现的一种靶标酶，参与植物中质体酮和生育酚的生物合成，同时也参与了大多数生物体的酪氨酸和苯丙氨酸分解代谢。HPPD在人及其它哺乳动物体内的主要作用是促进酪氨酸的代谢涉及泛醌等萜醌生物合成[24]。辅酶Q又称泛醌，辅酶Q作为心肌线粒体内膜的一种递氢体，参于电子传递过程，是细胞呼吸和代谢的激活剂。以人类辅酶Q10，节心肌细胞的代谢功能，能减轻心肌细胞因缺血或充血造成的组织损伤，从而保护心肌功能，并提供充足的ATP[25]。

钠钾ATP酶，或称钠泵、钠钾离子激活的腺苷-5'-三磷酸酶。Na+-K+-ATP的主要功能是将细胞内的Na+泵出和将胞外的K+泵入，平衡细胞内外Na+、K+，是生物电产生的基础， 也是细胞膜继发性主动转动的能量来源；Ca2+-ATP的主要功能是将细胞内 Ca2+泵入肌浆网，它同Na+-Ca2+交换共同维持细胞内Ca2+稳态。心肌肥厚时Na+-K+-ATP酶及Ca2+-ATP酶活性下降，导致细胞内Ca2+、Na+增多。胞内Na+增多引起Na+-Ca2+交换增加，进一步加剧细胞内Ca2+超载，从而引起心肌细胞凋亡[26]。

碳酸酐酶3（CA3）的可能生理作用主要有清除胞内CO2、调节胞内pH值、维持组织酸碱平衡、抗氧化、能量代谢和信号转导等方面均发挥重要的作用。由于CA3具有磷酸酶活性作为一种的新的蛋白质酪氨酸磷酸酯酶（PTP），它可能参与细胞内的信号转导。鉴于PTP可作为酪氨酸激酶的天然拮抗剂，因此CA3很可能对依赖酪氨酸磷酸化的信号转导通路会产生负面影响。而酪氨酸激酶与MAPK级联反应参与细胞的生长、增殖、分化，在高血压左心室肥厚心肌中呈现高表达[27]。这种碳酸酐酶3水平的降低将导致心肌细胞肥大，而增高将有助于抑制心肌细胞的进一步肥大、增生。

Transgelin也称转胶蛋白，是一种肌动蛋白压力纤维素相关的蛋白质，与凝胶剂起反应并能稳定体外的肌动蛋白凝胶剂。最本源功能是和肌动蛋白结合，从而参与细胞骨架重构和调整。可降低Rho激酶相关信号通路并增加肌动蛋白解聚，最终降低肌球蛋白轻链磷酸化。在心肌肥厚时Rho激酶相关信号通路被激活，Rho mRNA呈现出高表达[28]。Transgelin基因敲除小鼠研究表明该基因敲除后能改变血管平滑肌形态，增加ROS表达，激活NF-KB 等炎症通路[29]。

有报道显示血红蛋白-α（Hb-α）与脂多糖的相互反应能使脂多糖的生物学活性显著增加。此外脂多糖的致命性毒素的侵蚀性由Hb-α的出现而加强。Hb-α是通过裂解脂多糖来加强其生物学活性的。进一步的研究显示交链Hb-α与酰化内毒素的相互反应有静电性也有非静电的疏水性，这种性质使内毒素由非惰性转为活性形式， 不同交联Hb-α的浓度和不同的反应温度对Hb-α与内毒素的反应均有影响[30]。而脂多糖（LPS）广泛存在的致热原，是最常见诱导炎症反应的物质之一，它能够通过诱导NF-KB信号通路心肌细胞肥大[31]。在心室肥厚的作用有待进一步探索。

CD36基因（亦成为脂肪酸转位酶基因）编码有助于脂肪酸吸收及组织代谢的蛋白，在多种细胞表面表达，CD36在大鼠模型中對心肌有保护性作用。研究发现，CD36缺乏大鼠的心脏质量/体重指数比正常大鼠高10%，并且CD36缺乏的大鼠心肌对缺血的耐受力下降，表明CD36与左心室肥大相关[32]。

整合素家族是一类细胞粘附受体蛋白，其不仅能够介导细胞与胞外基质之间的粘附，还可以调节并整合胞内外信号激活相关信号通路从而影响多种细胞生物学功能。心脏中的心肌细胞和非心肌细胞都表达整合素， 研究表明， 整合素可以介导碱性成纤维生长因子（bFGF）和血管内皮生长因子（VEGF），而这两种因子在促心肌细胞的肥大中重要的作用[33]。在心室肥厚的作用有待进一步探索。

集聚蛋白对免疫细胞、神经细胞粘附分子、细胞外基质、蛋白多糖具有聚集作用，将疏散状态变成成簇状态以至能紧密结合[34]。蜱抗凝血肽（TAP）是从毛白钝缘蜱中分离的Xa因子的抑制剂。TAP是新型丝氨酸蛋白酶抑制剂，由60个氨基酸组成的单链酸性多肽，包括6个半胱氨酸残基，体外实验显示能抑制正常人血浆的凝固。在心室肥厚中的变化有待进一步探讨。

多项研究证实在高血压状态时C反应蛋白水平增高，且具有促进心室肥厚的作用，本项目研究显示在左室肥厚时下调，其反常变化需进一步探索。

4.3 SHR左心室肥厚的机制

血流动力学超负荷通过机械拉伸的直接作用及激活神经体液因子的间接作用引起是引起高血压左心室肥厚的起始动因。高血压时心肌细胞受到机械拉伸力的作用。从而导致细胞膜、以及细胞器上离子通道、跨膜蛋白的的改变引起细胞内因子及其介导的信号通路的传导，而激活的信号途径又会导致多种因子的活化，影响到细胞凋亡、炎性表达、细胞增殖分化，而促进心肌肥大，以代偿机械拉伸力。由于增高血压的持续性，导致细胞因子→信号途径→细胞因子呈现出恶性循环状态。本项目研究显示主要涉及Ca2+介导的信号通路；有丝分裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路；蛋白激酶C（PKC）信号通路；腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）信号通路；核因子-kb信号通路。

乙酰水解酶与乙酞水解酶属血小板活化因子体系，两者水平的上调表明血小板活化因子呈激活状态这将介导蛋白激酶C（PKC）信号通路，另外14-3-3蛋白、纤维蛋白原、α2-AP蛋白水平上调也会激活PKC，过量表达的 PKC可显著诱导心肌肥厚。

丝裂原活化蛋白激酶3、中性胆固醇酯水解酶1（nCEHs）、纤连蛋白（Fn）过度表达可以激活P38 MAPK途径，而激肽原1、碳酸酐酶3（CA3）的低表达可以解除对P38 MAPK途径抑制，过量表达的P38 MAPK途径可以促进细胞的肥大以及基质的增生。

纤维蛋白原水平上调可以激活ERK途径，血清锌α2糖蛋白（AG）水平下调可以解除脂联素对ERK途径的抑制，激活ERK途径致使热休克蛋白代偿性增高，最终导致心室向心性肥厚。

14-3-3蛋白、纤维蛋白原水平上调可以激活Ca2+介导的信号通路，导致钠钾ATP水平水平降低，细胞内钙超载，发生心肌肥厚。

血清锌α2糖蛋白（ZAG）、载脂蛋白H水平下调导致AMPK途径下调，而AMPK可以保护心肌缺血损伤， 限制各种因素所致的心肌肥厚。

中性胆固醇酯水解酶1（nCEHs）水平上调激活NF-kb途径、胶转蛋白水平下调可以解除对核因子NF-kb途径抑制，共同导致NF-kb途径表达上调，导致心肌肥厚。通过上述5条信号通路的协同作用，从心肌凋亡、细胞增殖增生、炎症等不同角度导致细胞内蛋白合成增加，细胞基底膜增生导致心室肥厚的发生，其余的蛋白则从促进抑制心肌肥厚蛋白降解（蛋白酶体），调节心肌能量代谢（HPPD、辅酶Q10），缺乏心肌保护（CD36）免疫反应（Ighg3）促心肌肥厚的作用。

4.4 小结

通过前期研究[35]及对以上变化蛋白质生物机制的研判：SHR左心室肥厚发生涉及心肌凋亡、细胞增殖增生、炎症等多种细胞因子，导致细胞损伤与保护作用失衡。

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（本文编辑 杨 瑛）