水杨酰苯胺类mglu5拮抗剂作用模式及体外抗肿瘤活性研究

张弦　周鑫　尹华　张昊霖　文菲　熊广华　曹德良　廖端芳　傅榕赓

〔摘要〕 目的 基于分子对接探讨水杨酰苯胺化合物Ⅰ-Ⅳ与代谢型谷氨酸受体5（metabotropic glutamate receptor 5， mglu5）之间的相互作用并测定化合物Ⅰ-Ⅳ的体外抗肝癌HepG2细胞增殖活性。方法 采用计算机软件，以mglu5结晶复合物5CGD为受体模板，将水杨酰苯胺化合物Ⅰ-Ⅳ进行分子对接研究；利用MTT法测定水杨酰苯胺化合物Ⅰ-Ⅳ对肝癌HepG2细胞的增殖抑制活性。结果 水杨酰苯胺化合物Ⅰ-Ⅳ与mglu5的活性口袋产生疏水作用以及与活性口袋关键氨基酸残基SER809产生氢键结合；水杨酰苯胺化合物Ⅰ-Ⅳ对肝癌细胞HepG2的抗增殖活性IC50值分别为2.55 μmol/L、3.99 μmol/L、3.12 μmol/L和7.55 μmol/L。结论 水杨酰苯胺化合物Ⅰ-Ⅳ与mglu5对接的结合信息有助于水杨酰苯胺类mglu5拮抗剂的结构优化和新型mglu5拮抗剂设计，该类化合物的抗肿瘤作用值得进一步研究。

〔关键词〕 水杨酰苯胺；代谢型谷氨酸受体5拮抗剂；对接；抗肿瘤

〔中图分类号〕R284.3 〔文献标志码〕A 〔文章编号〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2018.06.002

〔Abstract〕 Objective To study the interaction between the salicylanilides I-IV with metabotropic glutamate receptor 5 （mglu5） based on molecular docking and their antitumor activity in vitro. Methods The molecular docking study of salicylanilides I-IV were performed by using mglu5 as a receptor template by in silica software. In vitro cytotoxicity of salicylanilides I-IV to human hepatocellular carcinoma cell line HepG2 was measured by a MTT method. Results It was found that salicylanilides I-IV interacted with mglu5 binding site by hydrophobic interaction and a key hydrogen bond with amino acid residue SER809. These interactions were closely related to biological activity. Compounds I-IV showed inhibitory effect on the proliferation of HepG2 cells with the IC50 values of 2.55 μM， 3.99 μmol/L， 3.12 μmol/L and 7.55 μmol/L， respectively. Conclusion The binding information of salicylanilides with mglu5 would be useful for modifying the structure and designing novel mglu5 antagonists. The antitumor activity of compounds of this type would be further studied.

〔Keywords〕 salicylanilide； mglu5 antagonist； docking； antitumor

代謝型谷氨酸受体5（metabotropic glutamate receptor 5， mglu5） 属于G蛋白偶联受体家族的成员，广泛存在于中枢神经系统，并且在多种神经退行性疾病中发挥了至关重要的作用[1]。近年来的研究发现，mglu5不仅存在于脑组织，在许多外周器官和组织中也有表达，mglu5表达及活性的异常还与恶性肿瘤（如肝癌）的发生发展关系密切[2]。因此，

mglu5已成为相关疾病新药研究的热门靶点。

mglu5拮抗剂代表骨架为二芳基类为主的直线型分子[3-4]，而水杨酰苯胺mglu5拮抗剂Ⅰ-Ⅳ（结构如图1所示）是我们课题组前期将水杨酰苯胺这一分子骨架与4-苯胺基喹唑啉类mglu5拮抗剂（代表化合物A）分子骨架进行骨架跃迁，设计合成得到的新型mglu5拮抗剂[5-6]。目前水杨酰苯胺类化合物Ⅰ-Ⅳ与mglu5相互作用，以及体外抗肝癌细胞增殖活性的研究均无文献报道。由于mglu5的表达及活性异常与肝癌的发生发展关系密切，因此，本文通过对接研究揭示水杨酰苯胺类化合物与mglu5结合作用模式并初步测定了水杨酰苯胺类化合物Ⅰ-Ⅳ的体外抗肝癌增殖活性。

1 水杨酰苯胺类化合物Ⅰ-IV与mglu5结合模式研究

1.1 材料与方法

使用Tripos Benchware软件绘制化合物Ⅰ-Ⅳ、MPEP以及化合物A的三维结构，并对此三维结构进行能量优化、加氢、加电荷等预处理，将优化好的分子保存为mol2格式文件备用。

1.2 受体准备

所选取的mglu5的三维结构文件来源于RSCB蛋白质数据库（PDB code：5CGD）。这一蛋白晶体由A、B两条完全对称的亚单元组成，其中还包含了配体HTL14242。在分子对接前，使用Tripos Benchware软件对mglu5蛋白进行加氢、加电荷、去配体、去水分子等预处理，并保存为mol2文件格式备用。

1.3 分子对接方法和原理

Gold是一款由英国剑桥大学晶体数据中心开发的一款分子对接程序，采用遗传算法（GA）进行蛋白-配体柔性对接，从而计算大分子与小分子结合模式，具有精度高、可靠性高以及操作界面友好等特点。

对接定义活性口袋设定以HTL14242半径5？魡以内的氨基酸残基组成的活性口袋，即由ILE625、ILE651、SER654、PRO655、SER658、TYR659、ASN747、THR781、ILE784、TRP785、PHE788、VAL806、SER805、SER809、ALA810氨基酸残基构成。

Gold程序借用遗传算法将化合物Ⅰ-Ⅳ、MPEP、化合物A与mglu5对接，充分搜索构象空间，以找到分子相互作用的最优模式。Gold程序提供了多种相互作用打分，用拟合度（GoldScore Fitness）函数表示。根据拟合度函数值的大小判断分子对接的好坏，函数值越大则分子间相互作用越强，形成的复合物能量越低，越稳定。在Gold对接过程中不允许提前结束对接，对接过程中配体构象可翻转。如无特别说明，所有参数均采用Gold 3.0默认值。

2 化合物Ⅰ-Ⅳ体外抗肝癌HepG2细胞增殖活性

取对数生长期状态良好的为HepG2肝癌细胞（来源于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心）加入0.25%胰酶蛋白消化，使贴壁细胞脱落，制成细胞悬液，密度为5×104个/mL。分别以100 μL/孔，每孔5×103个细胞接种于96孔培养板中。置37 ℃，5% CO2孵箱内培养24 h。吸弃上清，然后分别加入200 μL不同浓度（0.1 μmol/L至25 μmol/L）的目标化合物，每组设8个复孔。培养72 h后，再加入5 mg/mL的MTT 20 μL/孔，继续培养4 h后吸弃上清，加入DMSO 150 μL/孔，微振荡器上振荡10 min，将试剂对照调零，用自动酶标仪在550 nm波长处测出细胞对照组和各药物组的吸收度，取各组均值，并计算细胞抑制率。计算化合物对细胞的抑制率（IR）。IR=[1-（实验孔OD值-空白孔OD值）/（对照孔OD值-空白孔OD值）]×100%，计算IC50值，使用软件Grapipad Prism 5.0拟合计算得到。

3 结果与讨论

化合物Ⅰ-Ⅳ与mglu5活性口袋对接结果如表1所示，函数值越大则分子间相互作用越强，形成的复合物能量越低，相对越稳定。

3.1 MPEP与mglu5结合模式分析

将MPEP对接到mglu5活性口袋中，如图2所示：MPEP在mglu5活性口袋中分别与关键的氨基酸残基SER809形成一个氢键，氢键键长为1.879×10-10 m。

MPEP结构中的A环进入mglu5活性口袋中由TRP785、PHE788、ILE651、VAL806、SER805等形成的疏水腔，TRP785的苯环结构能够与MPEP产生π-π堆积作用，对MPEP构象的稳定起到一定作用；MPEP结构中B环作用于另一疏水腔。在横跨活性口袋方向，ILE625、PHE788的位阻限制了化合物的长度。

3.2 化合物A与mglu5结合模式分析

如图3所示，将化合物A对接到mglu5活性口袋中，其在mglu5活性口袋中与一个关键的氨基酸残基SER809形成一个氢键，长度为1.792×10-10 m。

化合物A结构中的A环进入mglu5活性口袋中由TRP785、PHE788、ILE651、VAL806、SER805等形成的疏水腔，A环上的胺基作为氢键供体与关键的氨基酸残基SER809形成氢键。化合物A结构中的喹啉环刚性较强，分子趋于平面构象。

3.3 化合物Ⅰ與MPEP在mglu5活性口袋结合模式比较

鉴于化合物MPEP是代表性的mglu5拮抗剂工具药，如图4所示，首先将化合物Ⅰ与MPEP对接到mglu5活性口袋中，二者的苯环重叠性较好，均作用于mglu5的疏水口袋；化合物Ⅰ的酰胺结构和MPEP的碳碳三键结构的长度相近，两者都能与关键的SER809形成氢键。不同之处在于化合物Ⅰ和MPEP在与SER809形成氢键时分别提供氢键受体和氢键供体。结合体外活性结果，推测二者氢键产生的方式不同。

3.4 化合物Ⅰ与化合物A在mglu5活性口袋结合模式比较

如图5所示，将化合物Ⅰ与化合物A对接到mglu5活性口袋中，化合物Ⅰ的两个苯环与化合物A中的两个苯环在口袋中叠合较好，均作用于关键的疏水口袋，且两化合物都能通过胺基与SER809形成氢键。从对接结果看，化合物A的水杨酰苯胺结构中的羟基与羰基通过分子内氢键形成的“假”六元环构型能够很好的模拟化合物A中的喹啉结构。区别在于：喹啉环相对于水杨酰胺结构刚性强，而所设计的水杨酰苯胺化合物没有类似刚性结构的约束。上述对接结果也验证了设计思想的可行性，即将4-苯胺基喹啉结构通过骨架跃迁水杨酰苯胺结构，可以具有类似的作用模式。

3.5 化合物Ⅰ和化合物Ⅱ在mglu5活性口袋结合模式比较

如图6所示，将化合物Ⅰ与化合物Ⅱ对接到

mglu5活性口袋中。两者的芳环均作用于mglu5的疏水腔中，差异在于：与化合物Ⅰ相比，由于化合物Ⅱ的苯胺3碳位置上的氯原子被体积较大的三氟甲基取代，使得化合物Ⅱ与疏水腔存在一定的空间位阻，从某种程度上影响了化合物与mglu5产生氢键的强度，对接打分值与实测值正相关，即对mglu5拮抗活性化合物Ⅰ强于化合物Ⅱ（如表1所示）。

3.6 化合物Ⅲ和化合物Ⅰ在mglu5活性口袋结合模式比较

如图7所示，将化合物Ⅰ与化合物Ⅲ对接到mglu5活性口袋中。由于化合物Ⅰ与化合物Ⅲ在取代基上有较大的差异（化合物Ⅲ苯环上5位为溴原子，苯胺的取代基为2-氯-4-三氟甲基），使得化合物Ⅲ的作用模式与化合物Ⅰ有较大的差异：化合物Ⅲ有体积较大的三氟甲基且在苯胺的4位，使得整个化合物的长度增加，由于PHE788的大位阻的存在，使化合物Ⅲ结合构象产生了较大的偏移，结果使得其不能与mglu5活性口袋中的关键氨基酸残基SER809产生氢键。

3.7 化合物Ⅳ和化合物Ⅰ在mglu5活性口袋结合模式比较

如图8所示，将化合物Ⅰ与化合物Ⅳ对接到mglu5活性口袋中。由于化合物Ⅳ结构中苯胺上4位为较长的氰基，而活性口袋长度有限，使得化合物IV在口袋中的结合构象同样产生了较大的倾斜，不仅降低了其在疏水腔中产生的疏水作用，而且使得其不能靠近关键的氨基酸残基SER809产生氢键。因此，在活性上化合物Ⅳ对mglu5的拮抗活性远低于化合物Ⅰ。

3.8 化合物Ⅰ-Ⅳ对肝癌HepG2细胞增殖的影响

目标化合物Ⅰ-Ⅳ对肝癌细胞HepG2具不同程度的抗增殖活性，IC50值分别为2.55 μmol/L、3.99 μmol/L、3.12 μmol/L和7.55 μmol/L。目标化合物体外抗HepG2增殖实验结果与mglu5拮抗活性具有一定的正相关性，即化合物Ⅰ活性在4个目标化合物中抗增殖活性最强，化合物Ⅳ抗增殖活性最差。见表2。

4 结论

本课题组前期设计合成的水杨酰苯胺化合物Ⅰ-Ⅳ，通过与mglu5的活性口袋产生疏水作用以及与活性口袋关键氨基酸残基SER809产生氢键作用，从而拮抗mglu5，并对HepG2细胞增殖产生抑制，符合文献[2]报道的mglu5的表达与HepG2细胞增殖正相关这一规律。对接研究发现：水杨酰苯胺取代基的种类、个数以及取代位置对mglu5拮抗活性有较大影响，此结合模式提供的信息将为针对mglu5这一靶点设计抗肿瘤新化合物提供新方向。

参考文献：

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（本文编辑 苏 维）