不同栽培年限川桔梗中桔梗总皂苷和桔梗皂苷D的含量比较

李心怡 陈玲 马逾英 邓薇

中图分类号 R284.1 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2018）09-1249-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.09.23

摘 要 目的：建立测定川桔梗中桔梗总皂苷及桔梗皂苷D含量的方法，探索不同栽培年限川桔梗药材中2种指标成分的差异。方法：采用紫外-可见分光光度法测定川桔梗中桔梗总皂苷的含量；采用高效液相色谱法测定川桔梗中桔梗皂苷D的含量；比较一年生、两年生及三年生各10份川桔梗药材中桔梗总皂苷及桔梗皂苷D的含量。结果：一年生、二年生、三年生川桔梗药材中桔梗总皂苷含量的平均值分别为2.47%、3.01%、2.47%；桔梗皂苷D含量的平均值分别为0.23%、0.27%、0.33%；即一年生的样品中2种指标的含量均较低，二年生样品的桔梗总皂苷含量最高，三年生样品桔梗皂苷D的含量最高。结论：不同栽培年限的川桔梗药材的指标性成分含量具有一定差异，但二者间并未呈现相关性，建议选用栽培年限为二年生或三年生的药材。

关键词 川桔梗；桔梗总皂苷；桔梗皂苷D；栽培年限；含量测定

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish a method for content determination of total saponins and platycodin D in Platycodon grandiflorum from Sichuan and investigate the difference of 2 indexes in P. grandiflorum from Sichuan of different cultivated years. METHODS： The content of total saponins in P. grandiflorum from Sichuan was determined by UV spectrophotometry. The content of platycodin D was determined by HPLC. The contents of total saponins and platycodin D were compared among each 10 samples of annual， biennial and triennial P. grandiflorum from Sichuan. RESULTS： Average contents of total saponins in annual， biennial and triennial P. grandiflorum from Sichuan were 2.47%， 3.01%， 2.47%， respectively； average contents of platycodin D were 0.23%， 0.27%， 0.33%， respectively. The contents of 2 indexes in annual P. grandiflorum from Sichuan were in relative low level， while the content total saponins in biennial P. grandiflorum from Sichuan was the highest； the content of platycodin D in triennial P. grandiflorum was the highest. CONCLUSIONS： The contents of indexes are different among P. grandiflorum from Sichuan of different cultivated years. But there is no correlation between them. It is suggested to select biennial and triennial P. grandiflorum from Sichuan.

KEYWORDS Platycodon grandiflorum from Sichuan； Total saponins； Platycodin D； Cultivated years； Content determination

桔梗為桔梗科植物桔梗[Platycodon grandiflorum （Jacq.） A. DC.]的干燥根，为一常用中药，具有宣肺、利咽、祛痰、排脓的功效[1]，同时其也在布依族、朝鲜族、仡佬族、蒙古族、苗族、纳西族、土家族、瑶族、壮族等多个少数民族中广泛使用[2]，是我国销量最大的40种传统常用中药材之一[3]。桔梗还是一种药食同源的药材，其肉质根是东北朝鲜族制作泡菜的重要原料[4]。故桔梗除药用外，还广泛用于食品、化妆品等领域[5]。

桔梗中含有大量的三萜皂苷，其是药理活性中的主要成分[6]。现已经从桔梗中分离鉴别了四十多种单体皂苷[7-10]，桔梗皂苷D是其主要的活性成分[11]。四川省梓潼县是桔梗的道地产区之一，具有栽培历史悠久、栽培面积广等特点。由于市场价格的影响，川桔梗的栽培年限存在差异，多以二年生为主，也会出现一年生和三年生的情况。那么不同栽培年限对其皂苷类成分的含量及其品质有何影响，目前未见相关文献报道。笔者采用紫外法测定川桔梗中桔梗总皂苷的含量，高效液相色谱（HPLC）法测定桔梗皂苷D的含量，研究不同栽培年限对川桔梗品质的影响，为其最佳采收年限的确定提供研究基础。

1 材料

1.1 仪器

1200 HPLC仪，配二极管阵列检测器（美国Agilent公司）；A580紫外-可见分光光度计（翱艺仪器有限公司）；BP121S万分之一电子分析天平（德国赛多利斯股份公司）；SB-3200DTD超声波清洗器（宁波新艺超声设备有限公司）； HWS-26电热恒温水浴锅（上海一恒科学仪器有限公司）；SHB-III循环水式真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；RE-5203旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）。

1.2 药材

本试验所用的30份药材样品均来自四川省梓潼县自采的药材，其原植物经成都中医药大学药学院马逾英教授鉴定，为桔梗科植物桔梗。将样品清洗干净之后置于60 ℃恒温烘箱中干燥至恒质量，中药粉碎机粉碎，干燥密封保存于封口袋中，备用。样品产地及栽培信息见表1。

1.3 对照品、试剂与其他

桔梗皂苷D对照品（北京中科仪友化工技术研究院，批号：151110，纯度：≥98%）；甲醇和乙腈均为色谱纯，香兰素及其余试剂均为分析纯，水为纯水。

D-101大孔吸附树脂、大孔树脂色谱柱（长度：30 cm，内径：3 cm）均来源于成都科龙化工试剂厂。

2 方法与结果

2.1 桔梗总皂苷的测定

2.1.1 供试品溶液的制备 精密称取桔梗粉末1.00 g，准确加入70%甲醇40 mL，称定质量，超声处理40 min（功率：250 W，频率：40 kHz），放冷，再称定质量，用70%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过；精密量取续滤液20 mL，置于水浴上蒸干，残渣加水20 mL，微热使溶解，上样于已处理好的D-101大孔吸附树脂中，反复上样5次后用100 mL纯水洗脱，弃去洗脱液，再用200 mL 的70%乙醇洗脱，收集洗脱液，减压蒸干，残渣加70%甲醇溶解，转移至10 mL量瓶中，加70%甲醇至刻度，摇匀，即得。

2.1.2 对照品溶液的制备 精密称取桔梗皂苷D对照品适量，加70%甲醇制成每1 mL含1.135 mg的溶液， 即得。

2.1.3 测定波长的选择 精密移取供试品溶液和对照品溶液各200 μL置于试管中，70 ℃水浴条件下蒸干，加入10%香草醛试液0.5 mL、60%硫酸溶液5 mL，摇匀，60 ℃水浴加热15 min，冰水浴冷却3 min，随行试剂做空白对照，立即在紫外-可见分光光度计中取供试品溶液（样品编号：11）与对照品溶液于400～800 nm波长范围内进行扫描，结果见图1。

由图1可见，供试品溶液与对照品溶液的最大吸收波长均约为470 nm，故选取470 nm作为检测波长。

2.1.4 标准曲线的绘制 精密吸取桔梗皂苷D对照品溶液40、80、120、160、200、240 μL置于试管中，按“2.1.3”项下方法测定其吸光度（A）。以对照品溶液的质量浓度（c，μg/mL）为横坐标、A为纵坐标进行回归，得到方程为A=0.009c+0.027 9（R2=0.996 6，n=6）；表明桔梗皂苷D的检测质量浓度线性范围为8.25～49.53 μg/mL。

2.1.5 精密度试验 精密吸取对照品溶液200 μL，按“2.1.3”项下方法测定其吸光度，连续测定6次。计算其RSD值为0.04%（n=6），提示仪器的精密性较好。

2.1.6 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液（样品编号：11）200 μL，按“2.1.3”项下方法显色后于1、5、10、15、20、25、30、40、50、60 min时分别测定其吸光度，计算其RSD值为1.13%（n=6），表明供试品溶液放置在室温60 min内稳定性良好。

2.1.7 重复性试验 取同一份桔梗药材粉末6份（样品编号：11），每份约1.00 g，准确称定，按“2.1.1”项下方法制备成供试品溶液。精密移取各供试品溶液200 μL置于试管中，按“2.1.3”项下方法测定其吸光度。结果，供试品的总皂苷平均含量为2.12%，RSD值为1.94%（n=6）。

2.1.8 准确度试验 准确称取已知含量的桔梗药材粉末6份（样品编号：11），每份约0.05 g，加入相应量的桔梗皂苷D对照品，按“2.1.1”项下方法制备成供试品溶液。精密移取各供试品溶液200 mL置于试管中，按“2.1.3”项下方法测定其吸光度。结果，加样回收率为97.31%～101.18%，RSD为1.61%（n=6）。

2.1.9 测定方法 取各样品，按“2.1.1”项下方法制备成供试品溶液，再精密移取各供试品溶液200 mL置于试管中，按“2.1.3”项下方法测定其吸光度，依据标准曲线方程计算各样品中桔梗总皂苷的含量。

2.2 桔梗皂苷D的测定

2.2.1 色谱条件与系统适用性试验 色谱柱为Diamonil-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈-0.3%磷酸水（乙腈：0→20 min，10%→15%；20→35 min，15%→28%；35→50 min，28%→28%；50→60 min，28%→40%）；檢测波长为210 nm；流速为0.8 mL/min；进样量为20 μL；柱温为30 ℃。

取“2.2.2”和“2.2.3”项下供试品溶液（样品编号：11）和对照品溶液进样分析，色谱图见图2。

由图2可见，待测峰与邻峰分离良好。理论板数以桔梗皂苷D峰计不低于3 000。

2.2.2 供试品溶液的制备 精密称取供试品粉末2.00 g至锥形瓶中，加甲醇50 mL，密塞，称定质量，超声提取30 min（功率：250 W，频率：40 kHz），冷却；再次称质量，用甲醇补足减失的质量，过滤，水浴蒸干，加20 mL纯水微热使溶解，用水饱和的正丁醇萃取3次，每次20 mL，合并正丁醇层，减压蒸干，用甲醇溶解，定容至10 mL量瓶中，摇匀，过0.45 μm滤膜，即得。

2.2.3 对照品溶液的制备 精密称取桔梗皂苷D对照品适量，加甲醇制成每1 mL含1.4 mg的溶液，即得。

2.2.4 标准曲线的绘制 取1.4 μg/μL的对照品溶液4、8、12、14、18、22 μL，分别注入色谱仪中测定，记录色谱。以桔梗皂苷D的进样量为横坐标（x）、峰面积为纵坐标（y）绘制标准曲线，得到回归方程为y=177.2x-50.542（R2=0.999 8），结果表明桔梗皂苷D检测进样量线性范围为5.6～30.8 μg。

2.2.5 精密度试验 精密吸取对照品溶液10 μL，进样测定，连续进样6次，结果其保留时间的RSD为0.07%（n=6）；峰面积的RSD为0.08%（n=6）。提示仪器精密度良好。

2.2.6 重复性试验 取同一桔梗药材供试品（样品编号：11），按“2.2.2”项下方法制备成供试品溶液，进样测定，结果其保留时间的RSD为0.41%（n=6），峰面积的RSD 为2.18%（n=6）。表示方法重复性良好。

2.2.7 稳定性试验 取同一供试品溶液（样品编号：11）分别在室温下放置0、4、8、12、16、24 h后进样测定，结果其保留时间的RSD为0.58%（n=6），峰面积的RSD 为1.46%（n=6）。提示供试品溶液在室温下放置24 h内稳定。

2.2.8 准确度试验 准确称取已知含量的桔梗药材粉末6份（样品编号：11），加入相应量的桔梗皂苷D对照品，按“2.2.2”项下方法制备成供试品溶液，进样测定，计算得加样回收率为97.57%～101.37%（RSD=1.51%，n=6）。

2.2.9 测定方法 取各样品，按“2.2.2”项下方法制备成供试品溶液，在“2.2.1”项色谱条件下进样测定，依据标准曲线方程计算各样品中桔梗皂苷D的含量。

2.3 样品含量测定结果

各样品含量测定结果见表2。

表2结果表明，一年生样品总皂苷含量为2.12%～2.62%，其平均值为2.42%；桔梗皂苷D含量为0.13%～0.37%，其平均值为0.23%。二年生样品总皂苷含量为1.83%～4.93%，其平均值为3.16%；桔梗皂苷D含量为0.11%～0.47%，其平均值为0.27%。三年生样品总皂苷含量为1.65%～3.03%，其平均值为2.43%；桔梗皂苷D含量为0.25%～0.50%，其平均值为0.35%。在桔梗总皂苷含量方面，一年生与三年生相当，均低于二年生样品；在桔梗皂苷D含量方面，一年生<二年生<三年生，即一年生样品无论是桔梗总皂苷还是桔梗皂苷D的含量均最低，桔梗总皂苷含量以二年生更高，桔梗皂苷D的含量以三年生更高。

3 讨论

笔者在本试验前期测定桔梗总皂苷和桔梗皂苷D过程中曾对不同的提取方法、提取溶剂、提取时间以及料液比进行了考察，以选取最优条件进行提取，最终建立了本文的供试品溶液制备方法。

笔者在本课题组前期的产地考察中发现，由于受到市场价格的影响，一些药农仅仅栽培一年就将桔梗采挖，但本试验结果表明，一年生的桔梗药材无论是桔梗总皂苷的含量还是桔梗皂苷D的含量都最低，这可能是由于生长年限较短致成分富集不完全造成的，故建议采挖时最好选用二年生或三年生的药材。

将桔梗总皂苷和桔梗皂苷D的含量综合考虑来看，两者的含量与生长年限并未显示出明显的相关性，二年生和三年生药材中有效成分的含量各有不同。因此，笔者建议不应单独用某一成分作为评价其质量的标准，应从各方面进行综合考虑。

参考文献

[ 1 ] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S]. 2015年版.北京：中国医药科技出版社，2015：277.

[ 2 ] 贾敏如，张艺.中国民族药辞典[M].北京：中国中医药出版社，2016：1322-1324.

[ 3 ] 刘德军，冯维洗.桔梗[M].北京：中国中医药出版社，2001：13-15.

[ 4 ] 杨洪升，杨娜，李爽，等.东北药食同源植物[J].中国科技信息，2017，19（9）：59-61.

[ 5 ] 陆海洋，彭华胜，桂双英，等.桔梗质量评价的沿革与变迁[J].中国中药杂志，2017，42（9）：1637-1640.

[ 6 ] 李盈，王举涛，桂双英，等.桔梗的化学成分及药理作用研究进展[J].食品与药品，2016，18（1）：72-75.

[ 7 ] INADA A， MURATA H， SOMEKAWA M， et al. Phytoehemical studies of seeds of medicinal plants Ⅱ. A new dihydroflavonol glycoside and a new 3-methy-1-butanol glycoside from seeds of Platycodon grandiflorum A.DC.[J].Chem Pharm Bull，1992，40（11）：3081-3083.

[ 8 ] HE ZD，QIAO CF，HAN QB. New triterpenoid saponins from the roots of Platycodon grandiflorum[J]. Tetrahedron，2005，61（8）：2211-2215.

[ 9 ] 何美蓮，程小卫，陈家宽，等.桔梗皂苷类成分及其质量分析[J].中药新药与临床药理，2005，16（6）：457-460.

[10] MAZOL I， GLENSK M， CISOWSKI W， et al. Polyphenolic compounds from Platycodon grandiflorum A.DC.[J].Acta Pol Pharm，2004，61（3）：203-208.

[11] 邹葭霜，单进军，谢彤，等.桔梗皂苷D的研究进展[J].中成药，2014，36（4）：823-827.

（收稿日期：2017-07-24 修回日期：2017-09-15）

（编辑：刘 萍）