6种甘草酸盐乳膏中甘草酸的体外经皮渗透特性比较

涂碎萍 侯雅琴 边原 封永莉 李晋奇 张丽娟 陈璐

中图分类号 R961.1 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2018）09-1205-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.09.13

摘 要 目的：比较6种甘草酸盐乳膏剂中甘草酸的体外经皮渗透特性，为其进一步开发利用提供参考。方法：以改良的Franz扩散池和离体大鼠皮进行体外经皮渗透试验，采用高效液相色谱（HPLC）法测定6种甘草酸盐（甘草酸单铵、甘草酸二铵、甘草酸单钾、甘草酸二钾、甘草酸三钠、甘草酸二钠）乳膏剂中甘草酸24 h累积渗透量，并计算其透皮吸收速率以评价6种甘草酸盐乳膏剂的透皮特性。结果：6种甘草酸盐在大鼠皮肤的24 h累积渗透量大小顺序为甘草酸三钠（23.933 μg/cm2）>甘草酸二钾（22.952 μg/cm2）>甘草酸二钠（15.424 μg/cm2）>甘草酸单钾（10.703 μg/cm2）>甘草酸二铵（9.557 μg/cm2）>甘草酸单铵（1.621 μg/cm2）；经皮渗透速率快慢的顺序为甘草酸三钠[1.010 2 μg/（cm2·h）]>甘草酸二钾[0.974 5 μg/（cm2·h）]>甘草酸二钠[0.641 2 μg/（cm2·h）]>甘草酸二铵[0.399 9 μg/（cm2·h）]>甘草酸单钾[0.362 8 μg/（cm2·h）]>甘草酸单铵[0.072 6 μg/（cm2·h）]。结论：6种不同甘草酸盐乳膏剂中，甘草酸三钠体外经皮渗透速率最高。

关键词 甘草酸盐；乳膏剂；高效液相色谱法；透皮吸收

ABSTRACT OBJECTIVE： To compare in vitro percutaneous permeation characteristics of glycyrrhizic acid in 6 kinds of glycyrrhetate creams， and to provide reference for further development and utilization. METHODS： Modified Franz diffusion cell and isolated rat skin were adopted for in vitro percutaneous permeation test. 24 h accumulative permeation of glycyrrhizic acid in 6 kinds of glycyrrhetate creams （monoammonium glycyrrhizinate， diammonium glycyrrhizinate， monopotassium glycyrrhizinate， dipotassium glycyrrhizate， trisodium glycyrrhizinate， disodium glycyrrhetate） were determined by HPLC. The permeation characteristics of 6 kinds of glycyrrhetate creams were evaluated by calculating percutaneous absorption rate. RESULTS： 24 h accumulative permeation of 6 kinds of glycyrrhetate in rat skin in descending order was as follows： trisodium glycyrrhizinate （23.933 μg/cm2）>dipotassium glycyrrhizinate （22.952 μg/cm2）>disodium glycyrrhizinate （15.424 μg/cm2）>monopotassium glycyrrhizinate （10.703 μg/cm2）>diammonium glycyrrhizinate （9.557 μg/cm2）>monoammonium glycyrrhizinate （1.621 μg/cm2）. The percutaneous permeation rate in descending order was as follows as trisodium glycyrrhizinate [1.010 2 μg/（cm2·h）]>dipotassium glycyrrhizinate [0.974 5 μg/（cm2·h）]>disodium glycyrrhizinate [0.641 2 μg/（cm2·h）]>diammonium glycyrrhizinate [0.399 9 μg/（cm2·h）]>monopotassium glycyrrhizinate [0.362 8 μg/（cm2·h）]>monoammonium glycyrrhizinate [0.072 6 μg/（cm2·h）]. CONCLUSIONS： The permeation rate of trisodium glycyrrhizinate is the highest among 6 kinds of glycyrrhetate creams in vitro.

KEYWORDS Glycyrrhetate； Cream； HPLC； Percutaneous absorption

皮炎濕疹是临床常见的皮肤病，病程长、易反复，严重影响患者生活质量[1]。甘草酸是传统中药甘草的有效提取成分，具有皮质激素样作用，有保肝解毒、抗炎、抗病毒、抗肿瘤及免疫调节等作用[2-5]。甘草酸单铵、甘草酸二铵、甘草酸单钾、甘草酸二钾、甘草酸三钠、甘草酸二钠是甘草酸常见的6种盐，在临床上甘草酸盐是治疗湿疹的常见药物，多以静脉注射给药为主。但其口服或注射易出现蓄积，引起如水肿、低血钾、高血压及心脏异常等症状[4-5]。将甘草酸盐制成经皮给药的乳膏剂具有靶向、无创、缓释及无肝首关效应等优点，可提高患者的依从性[6]。本试验通过比较6种不同甘草酸盐乳膏剂中甘草酸体外经皮渗透结果以筛选出透皮性好的甘草酸盐，为进一步研制甘草酸盐外用制剂提供试验参考。

1 材料

1.1 仪器

Waters2695高效液相色谱（HPLC）仪（美国Waters公司）、BP211D电子天平（德国Sartorius公司）；优普UPR- II-5T超纯水器（成都超纯科技有限公司）；Biosharp 0.45 μm微孔滤膜（Biosharp生物科技有限公司）；RYJ-6B 药物透皮扩散试验仪（上海黄海药检仪器有限公司）；HC-2518高速离心机（安徽中科中佳科技有限公司）；W201D恒温水浴锅（上海申顺生物科技有限公司）。

1.2 药材与试剂

甘草酸单铵对照品（成都普思生物科技有限公司，批号：PS0061-0020，纯度：98.5%）；甘草酸单铵、甘草酸二铵、甘草酸单钾、甘草酸二钾、甘草酸三钠、甘草酸二钠原料药均购自湖北恒绿源科技有限公司（批号：HLY20160305-33、HLY20160305-31、HLY20160305-12、HLY20160305-13、HLY20160524-05、HLY20160306-35，纯度：均大于98%）；甘油、硬脂酸、单硬脂酸甘油酯、十六醇、十二烷基硫酸钠、羟苯乙酯原料药均购自湖南尔康制药股份有限公司（批号：000120161004、101820161001、105620160103、105120160502、102420160105、10362016- 0101，纯度：均大于99%）；白凡士林原料药（南昌白云药业有限公司，批号：20160101，纯度：99%）；甲醇、乙腈均为色谱纯；磷酸、乙醇为分析纯，水为纯化水。

1.3 动物

SPF级SD大鼠20只，♂，体质量180～200 g，由四川省人民医院实验动物研究所提供，实验动物生产合格证号：SCXK（川）2015-030。

2 方法与结果

2.1 乳膏剂的制备

2.1.1 空白乳膏剂 取70 g单硬脂酸甘油酯、140 g硬脂酸、85 g白凡士林、20 g十六醇、1 g羟苯乙酯混合，于水浴上加热至70 ℃左右，制得油相；10 g十二烷基硫酸钠、85 g甘油溶于适量纯化水中，并加热至70 ℃左右，得水相；将油相缓缓加入水相中，不断搅拌，凝固，即得空白乳膏剂。

2.1.2 6种甘草酸盐乳膏剂 取6种甘草酸盐原料药各5 g，分别置于研钵中，以等量递加原则加入“2.1.1”项下制备的空白乳膏剂适量，顺时针研磨，即得甘草酸盐乳膏剂，经含量测定其中甘草酸含量为10%，置于冰箱（4 ℃）中保存。使用前用玻璃棒混匀，避免药物沉降。

2.2 甘草酸盐含量测定方法的建立

2.2.1 色谱条件 色谱柱：Phenomenex C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-含0.05%磷酸盐缓冲液（35 ∶ 65，V/V）；流速：1.0 mL/min；检测波长：252 nm；柱温：30 ℃；进样量：20 μL。

2.2.2 甘草酸单铵标曲贮备液的制备 精密称取甘草酸单铵对照品10 mg，用90%甲醇溶液溶解定容至10 mL量瓶中，摇匀，即得质量浓度为1 mg/mL的甘草酸单铵标曲贮备液（甘草酸质量=甘草酸单铵质量/1.02）。取质量浓度为1 mg/mL甘草酸单铵标曲贮备液适量，以含20%乙醇的生理盐水溶液稀释，摇匀，即得质量浓度为60 μg/mL的甘草酸单铵标曲贮备液，置于冰箱（4 ℃）中保存。

2.2.3 甘草酸单铵质控贮备液的制备 精密称取甘草酸单铵对照品10 mg，用90%甲醇溶液溶解定容至10 mL量瓶中，摇匀，即得质量浓度为1 mg/mL的甘草酸单铵质控贮备液。取质量浓度为1 mg/mL的甘草酸单铵质控贮备液适量，以含20%乙醇的生理盐水溶液稀释，摇匀，即得高、中、低质量浓度（45.00、7.50、0.47 μg/mL）的甘草酸单铵质控贮备液，置于冰箱（4 ℃）中保存。

2.2.4 样品处理 取6种甘草酸盐乳膏剂的透体吸收液各200 μL，分别加入400 μL二氯甲烷，涡旋3 min，14 000 r/min离心5 min（离心半径6 cm），取上清液20 μL进样。

2.2.5 标准曲线的制备 取质量浓度为60 μg/mL的甘草酸单铵标曲贮备液适量，加入含20%乙醇的生理盐水溶液稀释，摇匀，分别制得质量浓度为60.00、30.00、15.00、7.50、3.75、1.87、0.94、0.47、0.23、0.12 μg/mL工作液，按“2.2.4”項下方法处理，进样测定。以各质量浓度溶液对照品峰面积积分值（y）对质量浓度（x，μg/mL）进行线性回归，得回归方程 y=1.80×104x+1.39×102（R2=0.999 2）。结果表明，甘草酸单铵质量浓度在0.12～60.00 μg/mL范围内线性关系良好。

2.2.6 系统适用性试验 分别取质量浓度为7.50 μg/mL的甘草酸单铵标曲贮备液、“2.1.1”项下空白乳膏剂、“2.1.2”项中的甘草酸二钠乳膏剂，按“2.2.4”项下方法处理后，按“2.3.2”项下方法处理24 h后，再按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱。结果表明，乳膏基质中的物质对测定无干扰，色谱峰形对称，峰宽小于0.5 min，与杂质分离度良好。色谱图见图1。

2.2.7 方法学考察 制备低、中、高质量浓度（45.00、7.50、0.47 μg/mL）质控样品进行方法学考察，结果，日内精密度试验的RSD≤1.79%（n=6），日间精密度的RSD≤1.93%（n=3）；常温下5 d内稳定性试验的RSD≤1.53%（n=3）；平均加样回收率为96.5%，RSD≤0.72%（n=9），均符合相关要求。

2.3 体外透皮试验

2.3.1 离体皮肤制备 取20只SD大鼠，迅速摘眼球处死，将腹部毛剃尽，剪下腹部皮肤，小心去除皮下组织和脂肪，用生理盐水清洗干净，保存于生理盐水中冷藏，24 h内使用，使用前检查皮肤的完整性[7-8]。

2.3.2 累积渗透量（Q）和透皮速率计算结果 取“2.3.1”项下SD大鼠皮肤，用生理盐水冲洗，自然固定在Franz扩散池上，有效扩散面积为3.14 cm2，使皮肤表面面向供药室，皮肤里层与接受液刚好接触。接受液为脱气并预热（32 ℃）的含20%乙醇的生理盐水溶液[8-11]，磁力搅拌转速为500 r/min，接受室水浴温度为32 ℃。供药室中先加入适量生理盐水，透皮30 min排除皮肤内空气及杂质后，重新换入脱气并预热（32 ℃）的含20%乙醇的生理盐水溶液。精密称取含药乳膏0.5 g，均匀涂抹于供药室大鼠皮肤上，6种甘草酸盐乳膏与皮肤完全接触。分别于0.25、0.5、0.75、1、2、4、6、8、10、12、24 h时取样0.5 mL，并及时补充0.5 mL接受液。接受液用0.45 μm水系微孔滤膜滤过，弃去初滤液，收集续滤液，作为测定用的供试品溶液。按照下列公式计算各时间点6种甘草酸盐乳膏剂的Q[12-13]：

式中，A为接收池面积，V0为接收液总体积，V为取样体积，n为取样次数，i为取样时间。ci为i时间取样时接受液的药物质量浓度，cn为n次取样时接收液中药物质量浓度。对药物渗透曲线（Q-t）作切线，切线的斜率即为经皮渗透速率（J）。24 h内不同时间累积渗透量见表1；累积渗透量与时间关系的方程式见表2；累积渗透量与时间的关系见图2。

表1、表2结果显示，在相同乳化体系中，6种甘草酸盐的Q大小为甘草酸三钠>甘草酸二钾>甘草酸二钠>甘草酸单钾>甘草酸二铵>甘草酸单铵；J快慢为甘草酸三钠>甘草酸二钾>甘草酸二钠>甘草酸二铵> 甘草酸单钾>甘草酸单铵。通过HPLC法测定6种甘草酸盐乳膏剂中甘草酸体外透皮量，结果发现以上6种不同甘草酸盐乳膏剂中甘草酸三钠和甘草酸二钾的体外经皮透过率相对较高。

3 讨论

本试验采用等量递加法将甘草酸盐原料药加入空白基质，以适量甘油和水改善黏度，研磨后制备成含药量达10%的甘草酸盐乳膏剂，研究其体外经皮渗透性。试验结果表明，在相同制备方法下，相同质量浓度的6种甘草酸盐乳膏剂其药物累积渗透量及经皮渗透率差异较大。原因可能与6种甘草酸盐乳膏剂的黏度及大鼠皮肤上分布的离子通道相关[14-15]。

药物透过角质层速度是药物经皮吸收的主要限速步骤。而多数研究显示，药物透过角质层主要通过细胞间质途径，忽略了上皮细胞膜的离子载体和通道蛋白对药物透过性的影响。通道蛋白是横跨细胞膜的亲水性通道，允许适当大小的离子顺浓度梯度通过。离子通道的特殊结构，只允许特定离子通过[16-17]。本试验结果中，Q大小为甘草酸三钠>甘草酸二钾>甘草酸二钠>甘草酸单钾；J快慢为甘草酸三钠>甘草酸二钾>甘草酸二钠>甘草酸单钾。显示不同甘草酸盐所含金属离子的单位摩尔数越多，其乳膏剂的累积渗透量与透皮吸收速率越高。结果提示其透皮吸收特性可能与上皮细胞膜上该金属离子的离子载体和通道蛋白的数量与细胞膜两侧浓度差相关。

药物在基质中的状态影响其吸收量，6种甘草酸盐乳膏剂中甘草酸单铵的乳膏剂黏度最大。通过调整水与甘油的比例、加入氮酮等仍无法改善其乳膏剂黏度。其原因与物理性质相关。甘草酸单铵难溶于水，在水包油型的乳膏基质中与基质亲和性差，不易分散且不易涂抹。为改善其缺陷，目前常用凝胶剂[17]或是乙醇脂质体作为甘草酸单铵载体，以改善甘草酸单铵的难溶于水的特点，从而提高其经皮渗透速率。

预试验结果表明，含10%、15%乙醇的生理盐水溶液对相关药物透皮参数无影响，但随着乙醇体积分数的增加，对相关参数的影响增大，含50%乙醇的生理盐水溶液可显著提高透皮速率。当乙醇体积分数超过20%时，正常皮肤表面的褶皱逐渐消失，并伴有脱落的鳞片状物、毛囊口扩展。因此，在大鼠皮肤的体外透皮试验中，接受液中乙醇体积分数超过20%时，将影响皮肤正常生理结构从而改变其屏障特性，因此接受液中的乙醇体积分数应控制在20%以下[18]。

本试验结果表明，6种不同的甘草酸盐乳膏剂具有不同的体外透皮特性，其中甘草酸三钠和甘草酸二钾的体外经皮渗透速率相对较高，可为进一步研制甘草酸盐外用制剂提供数据参考。

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（收稿日期：2017-08-29 修回日期：2018-01-26）

（编辑：刘明伟）