SCID 小鼠脏器质量和部分血液生理生化及免疫指标测定

袁水娟, 施国君, 唐慧青, 施美莲

(1. 上海交通大学, 上海 200240; 2. 上海灵畅生物科技有限公司, 上海 201402;3. 上海斯莱克实验动物有限责任公司, 上海 201615)

严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠是一种先天性淋巴细胞免疫缺陷动物，纯合的SCID基因特异性地阻碍了T和B淋巴细胞分化，使动物缺乏功能性的T和B淋巴细胞。它是Bosman等[1]于1983年在CB17近交系小鼠中发现的，比单纯的T细胞缺乏的裸小鼠在肿瘤免疫研究方面更具有优越性，是研究肿瘤、免疫、病原体感染、生殖等方面极好的材料和动物模型。

鉴于SCID小鼠从国外引进以来，由于饲养环境及营养水平等与国外都有差异，这些因素都可能导致小鼠的遗传性状、生理生化等生物学特性发生改变。本文针对本公司饲养的SCID小鼠，测定了其主要脏器重量、血生理生化、免疫球蛋白、补体和免疫细胞数据，为利用该品系进行生物医药、肿瘤学等方面研究者提供基础的生物学数据资料。

1 材料与方法

1.1 动物来源

在上海灵畅生物科技有限公司 [SCXK(沪)2013-0018] SPF级SCID小鼠第三代生产群中随机抽取4周龄、8周龄、16周龄各20只(雌雄各半)用于动物脏器质量、血液生理生化、免疫蛋白和补体数据测定;随机抽取8周龄20只(雌雄各半)用于免疫细胞数据测定。选取的动物采取随机方式, 未进行渗漏检测。

1.2 环境及饲养管理

实验用小鼠饲养在上海灵畅生物科技有限公司隔离中，隔离器内的空气为100级全新风, 室内温度 22～26 ℃, 相对湿度为 40%～60%, 换气次数每小时20次, 光照明暗各12 h∶12 h, 动物自由采食。

小鼠用饲料、垫料为上海普路腾生物科技有限公司提供[沪饲证(2014)04001]，经35 kGy60Co辐照，饲料的营养成分为: 粗蛋白24.5%～25.5%，粗脂肪5.5%～6.5%，粗灰分6.0%～6.5%，粗纤维4.0%～4.5%，水份≤10%，钙1.2%～1.5%，磷0.75%～1.0%，赖氨酸≥1.32%，蛋氨酸+胱氨酸≥0.78%。饮用水为酸化过滤纯水，pH值为2.5～3.5，并经121℃、40 min高压蒸汽灭菌。垫料每周更换一次, 进出隔离器的物品均进行121 ℃,30 min消毒灭菌处理。

1.3 主要仪器

日立7020全自动生化分析仪、Eppendorf 5427R离心机、美国BD公司流式细胞仪、Mettler toledo AL104电子称[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司，可读性0.0001 g]; 手术剪、眼科镊等常规手术器械。

1.4 实验方法

1.4.1 脏器质量的测定 电子天平称体质量后, 按动物体质量30 mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射麻醉, 眼眶静脉采血后, 脱颈椎施行安死术。立即剖取心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、胸腺、脑、睾丸、卵巢, 并用滤纸吸干组织表面水分, 称取脏器重量。

1.4.2 血常规指标测定 取 20 μL全血加 500 μL稀释液混匀, 用Sysmex KX-21N全自动血球分析仪检测, 指标为白细胞计数(WBC)、红细胞计数(RBC)、血红蛋白(HGB)、血细胞压积(HCT)、红细胞平均体积(MCV)、红细胞平均血红蛋白(MCH)、红细胞平均血红蛋白浓度(MCHC)、血小板(PLT)、红细胞体积分布宽度(R D W)、血小板平均容积(MPV)、血小板体积分布宽度(PDW)、淋巴细胞(LYM)、血小板大细胞比率(P-LCR)。

1.4.3 血液生化、免疫球蛋白和补体指标测定 取0.8 mL全血置离心管内，4 ℃冰箱内放置1 h后2 800× g离心10 min, 分离出血清，进行血液生化、免疫球蛋白、补体的测定。血液生化指标为总胆固醇(TCHO)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、血糖(GLU)、总尿素氨(BUN)、钙(Ca)、磷(P)。免疫球蛋白和补体指标为IgG、IgA、IgM、C3、C4。

1.4.4 免疫细胞测定 动物处死后取脾脏，尽量去除附着其上的脂肪组织，放入淋巴细胞分离液，研磨，将分离液转移至15 mL离心管内，覆盖200～500 μL的1640培养基, 800 ×g离心30 min, 吸出淋巴细胞层, 再加入10 mL 1640培养基, 250 ×g离心10 min收集细胞，倾倒上清液，流式细胞仪细胞计数，测定T细胞及亚群、B细胞(B220+)、NK细胞(NK1.1+)。

1.5 统计学方法

实验结果用软件SPSS 19.0单因素方差分析分析, 数值以表示, P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SCID小鼠脏器质量

从表1可见, 4周龄SCID小鼠不同性别间心脏、肺脏、脾脏、脑、肾上腺、胸腺质量差异均没有统计学意义。4周龄SCID小鼠的心脏、肺脏、肝脏、肾脏重量均显著小于8周龄和16周龄小鼠。SCID小鼠的胸腺重量与性别、周龄均无关，各数据间无显著差异。在8周龄时, SCID小鼠雌性和雄性的脾脏最小, 性别间存在显著性差异。

表1 SCID小鼠脏器质量 mg

2.2 SCID小鼠血液生理指标

从表2可见，4周龄不同性别的SCID小鼠WBC，RDW-CV含量无显著差异，而8周龄、16周龄在不同性别间有显著差异。4周龄、8周龄、16周龄的SCID雌鼠MCH水平均显著高于雄鼠。不同周龄SCID小鼠RBC、LYM含量，8周龄数值最低, 8周龄、16周龄均显著低于4周龄。不同周龄不同性别的SCID小鼠在PLT、RDW-SD水平上无显著差异。4周龄的SCID雌性、雄性鼠的PDW、MPV显著低于8周龄和16周龄的小鼠。

2.3 SCID小鼠血液生化指标

从表3可见, 16周龄SCID雌性、雄性小鼠TG水平均显著低于4周龄、8周龄雌性、雄性小鼠。8周龄、16周龄的SCID雌鼠LDL-C、ALP水平均显著高于雄鼠, 而GLU显著低于雄鼠。SCID雌性、雄性小鼠的Ca、P指标随着周龄增长逐步降低趋势。

表2 SCID小鼠血液生理指标

表3 SCID小鼠血液生化指标

2.4 SCID小鼠主要免疫球蛋白、补体指标

从表4可见，4周龄SCID小鼠的IgG、IgA、IgM水平显著大于8周龄、16周龄的SCID的小鼠 。8周龄的SCID小鼠5项指标无性别上差异，而16周龄的SCID小鼠5项雄性显著高于雌性。

2.5 SCID小鼠主要免疫细胞指标

CD3+在整体免疫细胞占比最小，而B220+占比最大。在性别上，T细胞、B细胞、NK细胞无显著差异(表5)。

表4 SCID小鼠主要免疫球蛋白、补体指标

表5 SCID小鼠主要免疫细胞 %

3 讨论

胸腺和脾脏是机体重要的免疫器官,其在一定程度上可以反映机体免疫功能的强弱。本文数据显示，SCID小鼠胸腺质量是随着周龄的上升也处于上升状态, 但不存在显著性差异, 说明小鼠胸腺的发育并不像正常非免疫缺陷小鼠那样出生后快速生长，性成熟达到高峰，以后逐渐退化萎缩，和国内学者的数据相符[2]。16周龄SCID小鼠胸腺这一免疫器官质量并没有萎缩, 可能说明SCID小鼠随着周龄的增大, 免疫能力也在逐步地恢复，因而实验中会出现渗漏现象[3]。8周龄的SCID小鼠雌性和雄性的脾脏质量最小，这提示在免疫学研究时要尽量使用8周龄左右的SCID小鼠。据资料显示[4]，SCID小鼠6～8周龄的免疫渗漏率为5.5%, 17～19周龄为26.7%。

本实验SCID小鼠生理结果与Charles River公司公布的2011年1～12月的8～10周龄的SCID小鼠数据基本相符，SCID小鼠生化数据中ALT、GLU偏低, 可能与动物营养有关。自1981年Siegel等[5]提出的“红细胞免疫系统”概念，随后许多学者对红细胞免疫功能进行了系统的研究，表明它与白细胞都参与了免疫系统，两者都具有多种免疫功能[6]。 实验结果显示，SCID小鼠WBC和RBC的含量随着周龄增加而增加可能是SCID小鼠的渗漏现象使部分免疫细胞得以恢复，免疫功能增强，其自身的免疫缺陷随着周龄的增加而自我恢复。实验结果显示SCID小鼠在RBC、LYM水平上，8周龄数值最低，8周龄、16周龄均显著低于4周龄，也表明在8周龄时SCID小鼠免疫功能最为低下。本文测定的3个周龄段SCID小鼠免疫球蛋白和补体与免疫功能正常小鼠相比，其抗体含量IgG、IgA、IgM水平均远低于正常小鼠的水平[7]，也证实SCID小鼠属于T、B细胞免疫缺陷动物。

脾脏是机体最大外周免疫器官，占全身淋巴组织总量的25%，含有大量的淋巴细胞和巨噬细胞，是机体细胞免疫和体液免疫的中心, 其中T淋巴细胞占35%～50%，B淋巴细胞占50%～65%。本文通过对SCID小鼠脾脏免疫细胞测定，显示在脾脏淋巴细胞中SCID小鼠T细胞含量最低，有活性的CD3+、CD4+、CD8+百分比含量很低，B细胞百分比含量最高，活性最高。此结果与外周血免疫细胞实验结果相比[8], 脾脏细胞实验中CD3+、B220+、NK1.1+明显高于外周血的百分比含量，表明这些免疫细胞在脾细胞中百分比含量更高，尤其B细胞更为突出。

SCID小鼠作为T、B细胞免疫缺陷动物模型，目前在生物医药研究领域和人类肿瘤移植方面使用非常广泛。本文通过对SCID小鼠主要脏器质量、血液生理生化、免疫球蛋白、补体及免疫细胞的测定与分析，可以为生产和研究单位更好地了解SCID小鼠的基础生物学特性数据。同时本实验测定的生理生化数据与国外SCID小鼠数据基本符合，也表明该品系自引种以来未发生生物学特性的明显改变。