植物核糖体失活蛋白研究进展

黄梦琦, 周 娴, 李婧姝,郭诗华,崔永红

(1.福建农林大学,福建 福州 350002；2.千景空间科技有限公司，贵州 贵阳 550004；3.福建省林业调查规划院, 福建 福州 350003)

19世纪末，首个核糖体失活蛋白从蓖麻(Ricinuscommunis L.)种子中分离出来，Matthew J walsh 证明其是一类抑制蛋白质合成的不可逆催化毒素[1]。目前RIPs已构成一类具有特征性的家族毒素，其中大部分由植物体分泌产生，包括自18种单子叶植物、122种双子叶植物等被子植物纲中的350余种植物中检测分离出的110多种RIPs[2]。

病原真菌、生物虫害是影响我国农作物产量和品质的重要因素之一。大面积使用高效内吸性杀菌剂，使植物病害的防治取得突破性进展，同时也导致病原菌对药剂的抗性问题日益突出。半个多世纪的研究表明[3]，植物体内RIPs的有效表达使其具有抗病原菌、抗生物虫害等功能，因而受到人们普遍关注[4]。

图1 核糖体失活蛋白的类型

1 核糖体失活蛋白研究概况

1.1 核糖体失活蛋白的种类

根据分子结构的差异特性,可将RIPs分为3类(图1)，简称Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅱ型。

Ⅰ型RIP是一种单链蛋白质，其分子量约为30kDa，多为碱性糖蛋白,具有RNA-N-甘氨酸酶活性,在活性位点区域内存在高度保守的活性裂隙残基和次级结构，如天花粉蛋白(Trichosanthin,TCS)、丝瓜毒蛋白(luffin)、美洲商陆抗病毒蛋白等。Ⅱ型RIPs由酶促活性A链和稍大的B链组成，对半乳糖结构的糖类呈现特异性[5]，是分子量约为65 kDa的二聚体蛋白。A链具有核糖体失活蛋白活性，与Ⅰ型RIP功能相似,B链是对半乳糖专一的凝集素，具有凝集活性。A、B两链通过二硫键相连，剧烈的疏水作用使其结合在一起。除了这两种典型的RIPs，从大麦(Hordeumvulgare)中检测分离出的一种JIP60的RIP(分子量大小约60 kDa)被称为Ⅲ型RIPs，它包含类似于I型RIPs的氨基末端结构域，先合成无活性的前体，经酶解加工后成为有活性的RIP[6,7]。该型RIPs并不常见，到目前为止，仅在大麦(JIP60)和玉米(b-32)这两种农作物中检测分离出Ⅲ型RIP。

1.2 核糖体失活蛋白的分布

核糖体失活蛋白在植物体内的含量较高，但规律性不强。除在少数几种细菌和真菌中发现RIPs外，其余几乎都来源于高等植物。Ⅰ型、Ⅱ型RIPs常位于植物的叶子、种子或根部，并且单链Ⅰ型RIP比Ⅱ型RIP更常见。有趣的是，Ⅰ型RIP如美洲商陆抗病毒蛋白和天花粉蛋白，其毒性低于Ⅱ型RIP如相思豆毒素和蓖麻毒蛋白，而这种毒性减弱的主要原因是Ⅰ型RIP不结合B链。当然，自然界也存在一些无毒性的Ⅱ型RIPS。植物的不同时期、不同组织部位，RIPs分布也存在差异,成熟种子中RIPs活力相对较高。

2 核糖体失活蛋白的应用领域

2.1 RIPs在植物保护中的应用

近年的研究已表明：植物基因编码翻译的RIPs对生物病害具有一定抗性，包括广谱性抗病毒、抗真菌甚至对昆虫也有一定抗性[8]，这也决定了RIPs具有失活自身核糖体、杀死自身细胞的可能性。为避免“自杀行为”的发生，RIPs进化出一套植物自身防御机制：RIPs以不具活性的前体存在，必要时再加工为活性状态，有活性的RIPs与自身核糖体是分离的。RIPs在老叶中含量增多，当植物衰老或遭受外界环境压力时，RIPs会被诱导或活性增加。这极有可能也是一种植物自身防御的机制。

RIPs的广谱抗性还体现在对昆虫的抑制、毒杀作用中。不同昆虫对RIPs的敏感性有所差异。低浓度的肥皂草素(Saporin)、蓖麻毒蛋白(Ricin) 可使翘翅目的棉铃象甲(Anthonomusgrandis)和四纹豆象(Callosobruchusmaculatus)死亡，但对鳞翅目的棉贫夜蛾(Spodopteralittoralis)和烟芽夜蛾(Heliothisvirescans)无明显作用。对昆虫产生作用的RIPs多为Ⅰ、Ⅱ型，这是由于Ⅱ型RIPs B链、部分I型RIPs具有凝集活性，可与昆虫细胞的特异性受体结合，对昆虫产生毒杀或抑制作用，可有效的保护植株不被虫害所侵扰。

2.2 核糖体失活蛋白在转基因植物中的应用

2.2.1 在转基因小麦中应用 植物病毒病是由植物病毒引起的一类重要病害,目前尚未有高效的抗病毒制剂。小麦作为世界上十大粮食产物之一，常受到各种病原病毒以及真菌危害。Balconi通过基因枪技术驱动玉米体内的b-32基因，将其转入小麦体内而得到转基因小麦，极大降低了FHB感染率，同时在其研究中提到，玉米b-32基因在小麦体内可产生通常不产生的抗真菌蛋白质，将小麦中最具破坏性的真菌病害被控制在显着水平[9]。这些结果证实，玉米b-32基因的整合可能是保护作物对抗真菌疾病的有效工具。Shahidi-Noghabi等使用接骨木(Sambucusnigra)的2型核糖体失活蛋白SNA-10的基因转化烟草植物，转基因烟草对蚜虫的生命参数，如存活率、净繁殖率、平均世代时间均产生显着影响[10]。该结果为RIPs对害虫具有抗性提供了进一步的支持。

2.2.2 在转基因烟草中应用 烟草是重要的叶用经济作物，但它在生长过程中常受到赤星病菌 (Alternariaalternata)、烟草花叶病毒(Tobaccomosaicvirus)等的侵害，致使烟草产量下降，造成严重的经济损失。Corrado等分析研究了PhRIPI的抗病毒活性，通过对PVX攻击转化的烟草(Nicotianatabacum)系，转基因烟草与未转化烟草相比病毒损伤数目显着降低，表明抗病毒蛋白的受控基因表达可增加病毒抗性。

2.2.3 在其他转基因植物中应用 前人对使用基因工程手段改善植物的抗性进行了深入研究，如利用植物的几丁质酶基因、利用植物的核糖体失活蛋白基因改善植物抗性等。在一些早期的以 RIP基因为目的基因的报道中，均是以烟草为受体植物进行实验，而近几年转RIP基因的受体植物已拓展至水稻、马铃薯等粮食作物。

郝文胜等通过农杆菌转化易感马铃薯植株、目的基因表达鉴定、相关抗病性鉴定，证实被转化马铃薯植株基因组整合的RIP基因在转录水平表达正常，且部分转基因马铃薯植株的蛋白提取物具有类似RIP基因产物的脱嘌呤活性[11]。

3 应用前景及展望

目前，RIPs已被广泛研究运用，在植物中有效表达已经变成重要的研究方向。在农业方面，RIPs的研究取得许多进展,但仍有很多问题无法解决：RIPs在植物中的表达活性如何有效提高；转基因植物是否可以同时拥有天然植物所具有的独特保护机制；RIPs作为免疫毒素所产生的副作用如何克服……但是一些RIPs对病原体和食肉动物，如真菌、细菌、病毒和昆虫是有毒的。RIPs的生理功能是起防御作用，即抵抗病虫害或恶劣环境，已有的转基因实验说明：导入RIP基因会使植物具有对真菌、病毒等的广谱抗性。这为后续利用RIP基因进行转基因作物育种提供了一条可行的途径。