富氢盐水抑制大鼠压疮深部骨骼肌NLRP3炎性小体活化

陈晓伟，张红英，刘 静

压疮(pressure ulcer)是长期卧床患者常见并发症。局部组织长时间挤压导致供血障碍，挤压解除后供血恢复导致形成再灌注病理改变，反复的缺血再灌注损伤导致皮肤及骨骼肌细胞凋亡、组织坏死。研究表明，压疮发生起始于深层骨骼肌，继而发展至表层皮肤，骨骼肌缺血再灌注损伤程度决定了压疮的病理进程[1]。骨骼肌成为治疗压疮的关键靶器官。炎性反应是骨骼肌缺血再灌注损伤的重要病理机制之一[2]。NLRP3炎性小体(NLRP3 inflammasome)在免疫应答和炎性反应中发挥重要作用，由NOD样受体、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)及天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1(caspase-1)共同组成。Stojadinovic等[3]证明，压疮深部骨骼肌NLRP3炎性小体各组件蛋白表达明显升高。提示NLRP3炎性小体参与了压疮的病理改变。

氧化应激是NLRP3炎性小体的重要活化机制[4]。氢分子具有很强的还原活性，可选择性抑制亚硝酸阴离子、羟自由基等活性氧(reactive oxygen species, ROS)成员的活性。研究表明，富氢盐水可有效抑制心、肺、肝、肾、脑等脏器缺血再灌注损伤[5]。Huang等[6]利用止血带制备骨骼肌缺血再灌注模型，发现再灌注前腹腔注射富氢盐水显著抑制骨骼肌细胞凋亡。本研究拟观察富氢盐水对压疮深部骨骼肌NLRP3炎性小体的干预效果，以探讨富氢盐水用于压疮治疗的可能性。

1 材料与方法

1.1 材料 健康雄性SD大鼠30只，购于军事医学科学院动物中心，体重(209.2±18.6) g。适应性饲养阶段，动物自由进食水，相对湿度45%～65%，温度(22±1)℃，12 h光照。大鼠饲养和干预均符合实验动物伦理学要求。

1.2 动物分组与造模 采用随机数字表法，大鼠分为3组：对照组(Control group, C)、压疮+生理盐水组(Pressure ulcer + saline group，PU+S)和压疮+富氢盐水组(Pressure ulcer + hydrogen-rich saline group，PU +HS)，每组10只。PU+S和PU+HS组大鼠参照文献[7]方法制备双侧股薄肌压疮模型。压疮模型建立成功后，PU+HS组大鼠每日腹腔注射饱和富氢盐水(氢气浓度0.6 mmol /L，10 ml/kg体重)一次，连续5 d。PU+HS组大鼠每日腹腔注射生理盐水(10 ml/kg体重)，连续5 d。对照组正常进食水，不予任何处理。各组大鼠均于末次腹腔注射后24 h断头处死，分离双侧股薄肌用于指标检测。

1.3 指标检测 (1)参照试剂盒(南京建成生物工程研究所)说明书操作，采用硫代巴比妥酸比色法，于紫外分光光度计测定反应体系吸光度值，计算骨骼肌组织丙二醛(MDA)含量(nmol/mg pro)。(2)参照大鼠骨骼肌组织IL-1β定量酶联检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)说明书操作，采用ELISA法，于荧光酶标仪测定各组骨骼肌组织IL-1β含量(pg/mg pro)。(3)参照试剂盒(南京建成生物工程研究所)说明书操作，采用荧光光分光光度法，于荧光酶标仪测定反应体系荧光强度。C组骨骼肌组织Caspase-1活性定义为1，PU+S和PU+HS组Caspase-1活性为与C组比较的相对活性。

1.4 骨骼肌组织NLRP3和ASC蛋白表达 Western blot法检测，以β-actin为内参。包含10 μg骨骼肌的组织匀浆与SDS上样缓冲液混合加热处理5 min，上样后经SDS-PAGE电泳分离，湿转法转移至PVDF膜，对应一抗振荡孵育12 h，PBS洗净后用辣根过氧化物酶标记二抗静置孵育1 h，PBS洗净后用显色试剂盒显影，X-ray胶片曝光记录。扫描条带灰度值，C组条带灰度值定义为100%，PU+S和PU+HS组为与C组比较的相对表达量。

2 结 果

2.1 对压疮深部骨骼肌MDA 、IL-1β含量和Caspase-1活性的影响 与C组比较，PU+S组MDA 、IL-1β含量和Caspase-1活性均显著升高(P<0.01)，PU+HS组IL-1β含量显著升高(P<0.05)。PU+HS组与PU+S组比较，Caspase-1活性、MDA和IL-1β含量显著降低(P<0.01，表1)。

表1实验鼠各组骨骼肌MDA、IL-1β含量和Caspase-1活性的变化

组别MDA(nmol/mg pro)Caspase-1 activity (Fold Change)IL-1β levels(pg/mL)C组13.15±1.931.00±0.230.47±0.07PU+S组27.40±4.42②1.42±0.35②1.05±0.19②PU+HS组14.92±3.11④1.13±0.25③0.69±0.18①④

注：C代表对照组，PU+S代表压疮+生理盐水组，PU+HS代表压疮+富氢盐水组。与C组比较，①P<0.05, ②P<0.01；与PU+S组比较，③P<0.05, ④P<0.01

2.2 对压疮深部骨骼肌NLRP3和ASC蛋白表达的影响 与C组比较，PU+S组NLRP3蛋白表达显著升高(178.49±18.62vs100.00±10.07，P<0.01)，PU+HS组NLRP3蛋白表达升高(122.29±19.96vs100.00±10.07，P<0.05)。PU+HS组NLRP3蛋白表达低于PU+S组(P<0.01)(图1A)。与C组比较，PU+S组ASC蛋白表达显著升高(129.47±18.62vs100.00±12.92，P<0.01)，PU+HS组ASC蛋白表达无统计学差异(105.33±16.67vs100.00±12.92，P<0.05)。PU+HS组ASC蛋白表达低于PU+S组(P<0.01)(图1B)。

图1 实验大鼠各组骨骼肌蛋白表达的变化

3 讨 论

氧化应激与诸多疾病发生密切相关，富氢盐水因其抗氧化特质受到研究者的关注。研究表明，大鼠腹腔注射富氢盐水1 h后，血浆氢分子浓度可达到μM水平，MDA含量显著下降，是一种有效的氢分子抗氧化给药模式[8]。本研究中，连续腹腔注射富氢盐水5 d可显著降低压疮深层股薄肌MDA含量。氧化应激水平受到ROS产生和抗氧化酶活性的共同影响，MDA是生物膜脂类过氧化最主要的产物，可反映机体氧化应激水平。研究表明，氢可选择性与强氧化性ROS直接发生还原反应[5]。此外，Meng等[9]研究证明，富氢盐水可激活转录因子Nrf2，后者可促进SOD、HO-1等一系列内源性抗氧化酶表达。以上提示，富氢盐水可有效抑制压疮导致的骨骼肌氧化应激。

IL-1β是炎性反应中重要的促炎细胞因子之一，以无活性前体形式合成并存在，在IL-1β转化酶催化水解反应后转化为具有促炎效应的成熟IL-1β。免疫组化结果显示，压疮表层皮肤及深层肌肉组织IL-1β高表达[1]。研究表明，IL-1β可通过刺激巨噬细胞过度释放细胞因子参与缺血对骨骼肌的损伤[10]。此外，IL-1β可激活泛素-蛋白酶体通路导致缺血状态下骨骼肌蛋白降解[11]。本研究表明，富氢盐水显著降低压疮深层股薄肌IL-1β含量。Okamoto等[12]在肠梗阻大鼠模型中也发现，连续腹腔注射富氢盐水10 d显著降低肠壁肌层IL-1β表达水平。以上提示，富氢盐水可有效抑制压疮深部组织炎性反应。

氧化应激与IL-1β产生密切相关，目前被证明的有两条通路：一是ROS激活转录因子NFκB，后者结合IL-1β启动子，促进其表达；二是ROS激活NLRP3炎性反应小体中识别蛋白NOD样受体，使之聚集形成NLRP3寡聚体，通过衔接蛋白ASC募集并激活效应蛋白caspase-1，后者活化后切割白介素1-β(IL-1β)，使之形成成熟炎性反应因子[13]。本研究表明，富氢盐水显著抑制了压疮深部骨骼肌NLRP3炎性小体活化，表现为NLRP3和ASC蛋白表达降低，同时caspase-1活性下降。研究表明，NLRP3炎性小体抑制剂INF4E明显抑制缺血再灌注导致的心肌线粒体损伤，部分恢复心脏收缩功能[14]。Ystgaard等[15]报道，与野生型鼠比较，NLRP3敲除鼠海马组织对缺血的抵抗力更强。以上提示，抑制NLRP3炎性反应小体活性是富氢盐水改善压疮的靶向之一。

总之，富氢盐水可能通过抑制氧化应激下调NLRP3炎性反应小体活化水平，进而抑制压疮诱导深部骨骼肌的炎性反应，是一种潜在的改善压疮的治疗方式。