拮抗凡隆气单胞菌的海洋芽孢杆菌chenj-1的分离与鉴定

陈 静， 夏艳秋， 顾冬莹， 朱 强

(江苏省海洋生物技术重点实验室/淮海工学院海洋生命与水产学院，江苏连云港 222005)

芽孢杆菌被认为兼有改善水生动物消化道和改良水环境的双重功效，作为益生菌在水产养殖上有着重要用途。目前，在水产养殖中应用得较多的芽孢菌主要有枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌等。芽孢菌在生长过程中产生大量的蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶等水解酶系，帮助机体消化、吸收饲料，降低饲料系数；产生B族维生素及维生素C，有助于提高机体的免疫活性；同时代谢产生乙酸、丙酸、丁酸等挥发性脂肪酸，可降低消化道内pH值和氨的浓度，维持机体的内环境，起到防病、抗菌的双重作用。

凡隆气单胞菌在医学上称维罗纳气单胞菌、维隆气单胞菌，兽医上常译作凡隆气单胞菌[1]，是近些年确定的气单胞菌科的新种，能引起人的局部和系统感染[2]，同时在水产养殖上也逐渐成为危害性较大的病原菌。如该菌曾引发孟加拉国鱼类的流行性溃疡综合征[3]。在国内，该菌感染能使丁、罗非鱼、中华绒螯蟹、泥鳅、瓯江彩鲤等水产动物患病[4-8]，给养殖业带来较大的经济损失。目前，气单胞菌病的水产防治主要是靠水体消毒和内服有效抗生素。抗生素滥用带来的耐药菌产生存在公共安全卫生隐患。所以，寻找绿色安全渔药成为当前的重点。本研究通过拮抗试验来筛选对凡隆气单胞菌有抑制作用的菌株并对其抑制特性进行研究，为开发水产微生物活性制剂提供理论和技术支持。

1 材料与方法

1.1 菌种

出发菌株：由笔者所在课题组分离自连云港海域海泥样品中，共36株。

指示靶病原菌：凡隆气单胞菌温和生物型(Aeromonasveroniibiovar.sobria)NQ菌株(由淮海工学院秦蕾博士分离自发病泥鳅，人工感染试验证实为泥鳅发病的致病源)。

1.2 培养基

TSB培养基：胰蛋白胨17.0 g，大豆蛋白胨3.0 g，NaCl 5.0 g，葡萄糖2.5 g，K2HPO42.5 g，蒸馏水定容至1 000 mL。

TSA培养基：胰蛋白胨17.0 g，大豆蛋白胨3.0 g，NaCl 5.0 g，葡萄糖2.5 g，琼脂粉15.0～20.0 g，K2HPO42.5 g，蒸馏水定容至1 000 mL。

1.3 试验方法

1.3.1 出发菌株对凡隆气单胞菌NQ拮抗试验 初筛：将凡隆气单胞菌NQ接种至TSB液体培养基中，于28 ℃、160 r/min 摇床培养24 h，取100 μL涂布在TSB固体平板上，然后将出发菌株点种到涂布好的TSB固体平板上，28 ℃培养48 h，观察拮抗效果及测量抑菌圈直径。复筛：将出发菌株接种于TSB培养基摇瓶发酵，将发酵液离心，取上清液用 0.22 μm 无菌滤膜过滤，在置于涂布凡隆气单胞菌的TSA平板上的牛津杯中加入50 μL上述滤液。于28 ℃培养一定时间后，测量发酵液的抑菌圈直径。

1.3.2 菌株的分类鉴定

1.3.2.1 形态特征 参照文献[9]，将菌株接种到TSA平板，于28 ℃培养24 h，观察菌落形态及细胞形态。细胞形态采用革兰氏染色和简单染色进行观察，并进行芽孢染色和鞭毛染色观察。

1.3.2.2 菌体的生理生化反应研究 采用细菌微量生化反应管鉴定。按照操作说明在细菌微量生化反应管中接入 50 μL 对数期菌株培养悬液，置于28 ℃恒温培养箱培养，18～24 h后观察并记录结果。

1.3.2.3 细菌的16S rDNA PCR扩增与测序

1.3.2.3.1 细菌DNA提取 (1)取菌株过夜培养液1.5 mL于EP管中，12 000 r/min离心2 min，弃去上清液。(2)加 567 μL TE缓冲液，用定量移液器吹打悬浮沉淀，并加30 μL 10%十二烷基硫酸钠(SDS)，15 μL 20 mg/mL蛋白酶K，混匀，37 ℃保温1 h。(3)加100 μL 5 mol/L NaCl，充分混匀；再加80 μL CTAB/NaCl溶液，混匀；65 ℃保温10 min。(4)用等体积酚 ∶氯仿 ∶异戊醇(25 ∶24 ∶1)抽提，离心4～5 min，将上清液移至干净EP管。(5)加0.6～0.8倍体积的异丙醇，颠倒混合，冰箱冷冻层静置15 min，沉淀DNA。(6)12 000 r/min 离心10 min使DNA沉淀，加40-TE溶解，-20 ℃ 保存。作为PCR模板。

1.3.2.3.2 PCR扩增 引物设计[10]：16S rDNA正向引物为(ALF165312)：5′-GAGAGTTTGATCCTGGCT-3′，16S rRNA的通用引物(反向引物：ALF165313)：5′-CGGCTACCT-TGTTACGAC -3′，以上引物均由上海生工生物工程服务有限公司合成。

基因PCR扩增：50 μL PCR反应体系：基因组DNA模板2 μL，10×PCR buffer 5 μL，10 mmol/L MgCl24 μL，2.5 μmol/L dNTP 0.5 μL，2.5 μmol/L上游引物和下游引物各1 μL，5 U/μLTaqTMDNA聚合酶(TaKaRa)0.5 μL，最后加无菌双蒸水至50 μL，混合。PCR反应程序：95 ℃预变性 5 min；94 ℃变性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共35个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统检查并拍照。PCR产物纯化后，送上海生工生物工程技术服务公司测序。

1.3.2.5 序列比对与系统发育分析 将所测定的16S rDNA序列通过NCBI-NLM中Nucleotide-nucleotide Blast程序与GenBank+EMBL+DDBJ+PDB数据库中核苷酸序列进行同源性分析[11]，并通过数据库下载与试验菌株亲缘关系较近并已经确证的序列，用Clustal X软件进行多序列比对，采用MEGA 4软件的邻接法进行系统发育分析，并构建系统进化树。

1.3.3 菌株生长曲线以及不同时间段发酵产物抑菌活性的研究 将菌株培养过夜摇瓶作为种子液以3%接种量接种大摇瓶28 ℃、160 r/min摇床培养，分别取不同时间培养液测定D600 nm值和用双层平板牛津杯法测定发酵离心清液的抑菌圈大小，绘出生长曲线和不同发酵时间抑菌圈大小。

2 结果与分析

2.1 凡隆气单胞菌拮抗分离、筛选

通过对36株出发菌株初筛和复筛试验，得到1株对凡隆气单胞菌(Aeromonasveronii)NQ拮抗活性明显的菌株 chenj-1。由表1、图1可知，菌株chenj-1对凡隆气单胞菌具有较强的拮抗作用，并且可知其主要拮抗物质为胞外产物。

表1 chenj-1菌株对凡隆气单胞菌的拮抗效果

2.2 菌株的分类鉴定

2.2.1 形态特征 菌株chenj-1在TSB培养基上呈淡黄色菌落，表面粗糙，边缘不整齐。由图2可知，菌株chenj-1革兰氏染色呈阳性，短杆状、两端钝圆，多单个或成对出现，有芽孢，芽孢囊稍有膨大、呈椭圆形，中生到次端生，有稀疏的周生鞭毛。根据形态特征初步判断菌株属于芽孢杆菌属(Bacillussp.)。

2.3 菌株的生理生化鉴定

根据表2、图2，结合生理生化鉴定和细胞形态学分析，并参照《伯杰细菌鉴定手册》[12]及常见细菌系统鉴定手册[9]对菌株chenj-1初步归类为革兰氏阳性芽孢杆菌属。

表2 菌株chenj-1生理生化反应

2.4 菌株chenj-1 16S rDNA序列分析

PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，由凝胶成像系统下显示的图像可知，引物扩增出的序列长度约为1.5 kb(图3)，符合常规的16S rDNA序列长度。

经测序，菌株chenj-1 16S rDNA核苷酸序列大小为 1 398 bp，其序列已在GenBank中登记，登记号为JN051503。经与GenBank数据库中报道的16S rDNA核苷酸序列比对，选取芽孢杆菌属各种的16S rDNA核苷酸序列与菌株的16S rDNA核苷酸序列构建系统发育树。由图4可知，菌株与B.amyloliquefacien(X60605、AY608741、AY603658、DQ993675)位于同一簇群，亲缘关系最近。根据菌株的形态特征、生理生化试验、16S rDNA核苷酸序列分析及系统发育分析，将菌株初步鉴定为海洋解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)。

2.5 菌株chenj -1生长曲线及不同发酵时间抑菌活性

将菌株chenj -1培养过夜摇瓶作为种子液以3%接种量接种大摇瓶发酵培养(28 ℃，160 r/min)，分别取不同时间发酵液测定D600 nm值和用双层平板牛津杯法测定发酵离心上清液的抑菌圈大小，绘出生长曲线和不同发酵时间抑菌圈大小。

由图5可知，菌株chenj-1生物量在20 h后进入稳定期，28 h发酵上清液的抑菌活性最高，抑菌圈直径为 15.8 mm，说明抑菌活性物质在稳定期大量产生并在稳定中后期积累，对于扩大生产具有指导意义。

3 结论与讨论

芽孢杆菌属被认为是一类产生多种抗微生物活性物质的微生物[13-14]，而解淀粉芽孢杆菌作为芽孢杆菌属的一员，也有不少文献展示其在抑制病原微生物方面的活性，杨胜远等获得1株解淀粉芽孢杆菌K6菌株有广谱抗菌活性，包括对细菌、酵母、霉菌和白色念珠菌都具有抑制作用[15]，Lim等从解淀粉芽孢杆菌RX7菌株分离了1种广谱拮抗多种病原细菌和白色念珠菌的细菌素[16]；而Seung等、Alvindia等和Calvo等分别获得具有控制植物真菌性病原微生物的解淀粉芽孢杆菌菌株CNU114001、DGA14、BUZ-1[17-19]。

本试验采集江苏省连云港及附近海域海泥、海水及海洋生物样品，分离得到36株海洋芽孢杆菌并从中筛选到1株强拮抗凡隆气单胞菌的菌株chenj -1。通过形态学、生理生化(包括耐盐性)试验及16S rDNA基因比对初步归类为海洋解淀粉芽孢杆菌。在对菌株chenj -1生长曲线及其不同时间段发酵代谢产物的抑菌活性初步研究发现，菌株生物量与代谢活性产物量呈正相关，生物量在20 h达到最大值并进入平衡期， 28 h发酵液抑菌圈直径最大(15.8 mm)。试验结果为生物防治由凡隆气单胞菌引起的水产动物疾病提供了理论依据。经初步试验，B.amyloliquefacienchenj-1其硫酸铵盐析产物抑菌活性有所提高，但具体活性物质的结构和组分需要进一步研究。