中国南阳黄牛HDAC1基因SNP检测及与生长性状的相关性分析

杨 颖， 陆 江， 李湘萍， 佘 纳， 唐核心， 石德顺， 吕祁峰， 徐照学

(1.广西大学动物科学技术学院，广西南宁 530004； 2.上海交通大学附属上海市第九人民医院，上海 200002；3.湖北医药学院麻醉学研究所及附属太和医院麻醉科，湖北十堰 442000； 4.河南省畜牧研究所，河南郑州 476800)

南阳黄牛为中国五大良种黄牛之一，2006年被列入国家畜禽遗传资源保护名录，役肉兼用。肉牛的生长性状和屠宰性状是其最重要经济性状之一。而牛的胴体和肉质都受遗传因素影响，并可以从DNA水平上加以选择、操作[1-2]。组蛋白去乙酰化在基因转录及信号转导、细胞增殖和细胞分化方面发挥重要作用[3-6]。组蛋白去乙酰化酶(HDAC)与基因的转录活动有关。研究表明，不活跃的染色质呈去乙酰化状态，而转录活跃区域核小体组蛋白高度乙酰化[3-6]。本试验主要探讨南阳黄牛HDAC1基因的区域位点多态性，以及其与经济性状的关联性，以期为南阳黄牛的遗传育种和改良提供参考，为新品系的培育提供依据。

1 材料与方法

1.1 样品

河南南阳纯种黄牛血液样品15头份，均来自南阳黄牛保种场。

1.2 引物设计

HDAC1基因Intron 4-Intron 5区扩增片段引物：

上游引物：5′-GGACTTTGTGACAGGCTTG-3′，下游引物：5′-GGAGAGGGAAGTGGGAAC-3′，Tm：60 ℃。

HDAC1基因Intron 10-Intron 11区扩增片段引物：

上游引物：5′-CCACACACCCCTAATTGAA-3′，下游引物：5′-GCAAGTCAGAAGAGCCTACA-3′，Tm：57 ℃。

HDAC1基因3′UTR区扩增片段引物：

上游引物：5′-GGGCACACATTACTTTTCTAGTA-3′，下游引物：5′-TGTACCATTTTATTACAAAGATTC-3′，Tm：55 ℃。

1.3 PCR扩增产物处理及DNA序列比对

由北京艾德莱生物科技有限公司琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒完成纯化、回收，回收后由宝生物公司进行DNA测序，经过Ebi在线软件比对分析。

1.4 SSCP-PAGE

蛋白产物加入变性缓冲液后高温变性，10%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，随后硝酸银染色。

1.6 统计方法

依据参考文献[1-2]所述方法利用SAS统计软件进行分析，具体模型：Y=μ+G+bX+e，其中Y为性状表型值，μ为平均值，G为基因型效应(包括加性效应和显性效应)，b为屠宰体质量的回归系数，X为屠宰体质量，e为残差。

2 结果与分析

2.1 南阳黄牛HDAC1基因Intron 4-Intron 5片段位点多态性检测

通过测序比对分析，未发现Intron 4-Intron 5片段存在位点多态性(表1)。

表1 南阳黄牛HDAC1基因Intron 4-Intron 5片段序列比对

南阳黄牛混合DNAHDAC1基因Intron 4-Intron 5片段PCR-SSCP检测结果显示，未发现复合多条带，未出现多态性(图1-B)。结合DNA-PCR产物测序和PCR-SSCP方法，在已测南阳黄牛群体中，HDAC1基因在Intron 4-Intron 5片段无多态性位点。

2.2 南阳黄牛HDAC1基因Intron 10-Intron 11片段的位点多态性检测

南阳黄牛HDAC1基因Intron 10-Intron 11片段PCR扩增产物纯化回收测序，经Ebi在线软件比对分析得出，HDAC1基因在Intron 10-Intron 11片段依自己测序顺序的第110 bp处有1个多态性位点，为A/G突变(表2)。

根据测序图谱判断，多态性位点基因型分别为：GG纯合子、AA纯合子和AG杂合子3种基因型(图2-B至图2-D)。

2.3 南阳黄牛HDAC1基因3′-UTR非翻译区多态性位点检测

南阳黄牛HDAC1基因3′非翻译区扩增产物纯化回收后测序，经过Ebi在线软件比对分析结果。由表3可知，在南阳黄牛目标群体中HDAC1基因3′-UTR非翻译区序列有2个突变位点。结合测序图谱，依自己测序顺序的第49 bp处位点基因型分别存在A/C碱基型突变，基因型分别为AA纯合子、AC杂合子(图3-B、图3-C)；第 199 bp 处位点存在T/C碱基多态性，基因型为TT纯合子和TC杂合子(图3-D、图3-E)。

2.4 南阳黄牛HDAC1基因Intron 10-Intron 11区和3′-UTR非翻译区基因型频率分布

统计分析，南阳黄牛HDAC1基因的Intron 10-Intron 11区和3′-UTR非翻译区的碱基多态性位点基因及基因型频率。由表4可知，Intron 10-Intron 11区110 bp处的A/G多态性位点基因型为GG的个体占53%，基因型为AG的个体占33%，纯合子AA基因型占比最小，仅占14%。其中G等位基因核苷酸占总碱基数的70%，A等位基因核苷酸占总碱基数的30%。

由表5可知，在3′-UTR非翻译区的2个SNP位点中，在 49 bp位点处的A/C突变， AA基因型频率(67%)远大于AC基因型(33%)，而CC基因型的频率为0%；在核苷酸总百分比上，84%为A核苷等位基因，C核苷等位基因仅占16%。

由表6可知，在3′-UTR非翻译区第199 bp位点处的T/C多态性突变中，未发现CC基因型，TT基因型和TC基因型分别占到了58%和42%；在总核苷酸数量的比例上，T核苷等位基因占到了79%，C核苷等位基因仅占到了21%。

2.5 南阳黄牛HDAC1基因多态位点与经济性状关联分析

2.5.1 南阳黄牛HDAC1基因Intron 10-Intron 11区A/G(110 bp)SNP突变位点与经济性状关联性分析 应用SAS软件reg和glm程序，进行南阳黄牛HDAC1基因Intron 10-Intron 11区不同突变位点基因型与包括胸围、坐骨端宽、体高、体长等表现型性状进行遗传效应估计和关联性分析。结果表明，AG基因型的南阳黄牛，腰角宽(cm)和体长(cm)明显高于AA基因型(P<0.05)。GG基因型的南阳黄牛，日增质量(kg)明显高于AG基因型(P<0.05)。其余生长性状在不同基因型个体中比较无显著差异。A加性效应和A/G显性效应在体长(cm)、腰角宽(cm)、日增质量(kg)生长性状上存在差异显著(表7)。上述加性和显性效应结果提示此SNP突变位点可为分子育种培育优秀品种提供一定的参考价值。

2.5.2 南阳黄牛HDAC1基因3′-UTR区A/C(49bp)SNP突变位点与经济性状关联性分析 分析发现，体长性状AC基因型群体比AA基因型群体明显升高，二者差异极显著(P<0.01)。体高(cm)、尻长(cm)、十字部高(cm)和日增质量(kg)，AC基因型群体比AA基因型群体升高明显，差异达显著水平(P<0.05)，但它们均没能达到极显著水平。AC基因型相较于AA基因型群体，在经济性状方面有如此多的显著优异特性，提示此SNP多态性位点可为分子育种提供参考(表8)。

2.5.3 南阳黄牛HDAC1基因3′-UTR区T/C(199 bp)SNP突变位点与经济性状关联性分析 由表9可知，与生长性状关联分析发现不同基因型个体在各性状中均无显著差异(P>0.05)。

表3 南阳黄牛HDAC1基因3′-UTR非翻译区序列比对

3 结论与讨论

基因加性效应又称为“育种值”，是等位基因的累加效应，上下代可以固定遗传。本研究中南阳黄牛HDAC1基因Intron 10-Intron 11区A/G(110 bp)SNP突变位点出现3种基因型，杂合子AG和纯合子AA、纯合子GG。结果表明，AG基因型的南阳黄牛在腰角宽(cm)和体长(cm)显著高于AA基因型(P<0.05)。GG基因型的南阳黄牛日增质量(kg)显著高于AG基因型(P<0.05)。其余生长性状在不同基因型个体中比较无显著差异。A加性效应正值说明纯合型AA比GG有增加性状值的趋势，负值则反之。若加性效应达到显著水平(P<0.05)，表示其可信度>95%，育种值高。A加性效应和A/G显性效应在体长(cm)、腰角宽(cm)、日增质量(kg)生长性状上存在差异显著[1-2]。显性效应是基因位点内等位基因之间的互作效应，能遗传但不能固定，是主要产生杂种优势的部分[1-2]。本研究中南阳黄牛HDAC1基因Intron 10-Intron 11区A/G(110 bp)SNP突变位点A/G显性效应在体长(cm)、腰角宽(cm)、日增质量(kg)生长性状上存在差异显著。上述加性效应和显性效应结果提示，此南阳黄牛HDAC1基因Intron 10-Intron 11区A/G(110 bp)SNP突变位点可能为分子育种培育优秀品种提供一定的参考价值[7-10]。

本试验在南阳黄牛HDAC1基因3′-UTR区发现了2个突变位点，分别为A/C(49 bp)SNP和T/C(199 bp)SNP突变位点[1，11-15]。应用SAS软件分析了南阳黄牛HDAC1基因 3′-UTR 区A/C(49 bp)SNP和T/C(199 bp)SNP 2个突变位点与腰角宽、尻长、十字部高、日增质量、体质量、体长、体高、胸围、坐骨端宽、管围等生长性状的关联评估分析发现，南阳黄牛HDAC1基因3′-UTR区A/C(49 bp)SNP突变位点对南阳黄牛体长性状产生极显著影响，即AC基因型群体比较于AA基因型群体，体长增加极显著(P<0.01)。在体高(cm)、尻长(cm)、十字部高(cm)和日增质量(kg)方面，AC基因型比AA基因型升高亦明显，差异达显著水平(P<0.05)，但没能达极显著水平。AC基因型相较于AA基因型群体，在经济性状方面有如此多的显著优异特性，提示此SNP多态性位点可为分子育种提供重要参考，可作为提高经济性状的优良育种目标基因选择[1，16-20]。

表4 南阳黄牛Intron 10-Intron 11区A/G(110 bp)多态性位点基因型频率和等位基因频率分布

表5 南阳黄牛3′-UTR非翻译区A/C(49 bp)突变位点基因 型频率和等位基因频率分布

表6 南阳黄牛3′-UTR非翻译区T/C(199 bp)突变位点基因 型频率和等位基因频率分布表

表7 南阳黄牛HDAC1基因Intron 10-Intron 11区A/G(110 bp)SNP突变位点与经济性状关联性分析结果

注：估计值均为最小二乘均数±标准误。在同一比较组内，字母不同表示二者之间差异显著；其中小写字母表示差异显著(P<0.05)，大写字母表示差异极显著(P<0.01)。在基因效应比较中，加性效应正值表示A等位基因升高性状表型值；加性效应负值表示A等位基因降低性状表型值；“*”表示P<0.05，效应显著。下表同。

南阳黄牛HDAC1基因mRNA 3′-UTR非翻译区T/C(199 bp)SNP位点与生长性状关联性分析发现，各性状在不同基因型群体的均值均无显著差异。因此，本研究提示此SNP多态性位点不可成为分子育种的理想基因型标记选择。

单核苷酸多态性(SNP)可能直接影响表达水平或蛋白质结构变化[7-10，16-20]。本研究在南阳黄牛HDAC1基因Intron 4-Intron 5区SNP位点多态性的检测中，使用PCR-SSCP的方法分析是否存在多态性，以及联合PCR产物直接测序方法同时使用，可以尽量避免假阴性结果。

表8 南阳黄牛HDAC1基因3′-UTR区A/C(49 bp)SNP 突变位点与经济性状关联性分析

注：CC基因型频率为0%。

表9 南阳黄牛HDAC1基因3′-UTR区T/C(199 bp)SNP 突变位点与经济性状关联性分析

注：CC基因型频率为0%。