重庆地区兔腹泻病原菌分离鉴定及检测方法的建立

许国洋，沈克飞，徐登峰，付利芝，张素辉，王孝友，杨 柳

(重庆市畜牧科学院，重庆 402460)

近年来，随着畜牧业的不断发展，养兔业已成为重庆地区一项发展潜力巨大的产业。但由于重庆地区的独特地理特征和湿热气候环境，为病原菌滋生创造了有利条件，成为疫病多发的主要诱因之一，严重影响养兔业的健康可持续发展。兔腹泻是一类临床上表现腹泻症状的疾病，表现为排粪频繁，粪便稀软，呈粥样或水样便，轻者食欲减退，精神不振，排粪稀软，呈粥样或水样，病兔全身反应较轻，虚弱、消瘦、不爱运动[1-3]；重者体温升高，食欲废绝，精神倦怠，严重腹泻，呈水样常混有血液或胶冻样黏液，粪便恶臭[4]，腹部触诊有明显痛疼反应，呈脱水和衰竭状态及自体中毒症状，结膜发绀，脉博细弱，呼吸促迫，常因虚脱而死亡[5-6]。目前，兔腹泻病在重庆地区有流行趋势，多发于幼兔，给养兔业造成巨大经济损失。兔腹泻病种类多样，病因复杂，其中，由病原菌导致的细菌性腹泻最为重要[7]。兔细菌性腹泻主要包括大肠杆菌病、产气荚膜梭菌病、泰泽氏菌病、沙门氏菌病、金黄色葡萄球菌病和铜绿假单胞菌病等，其中，以大肠杆菌病和产气荚膜梭菌病发生率较高[8]。由于兔细菌性腹泻各病原菌致病性与耐药性差异，导致其在不同地区呈不同流行趋势，危害也各有差异，给疫病防控带来巨大困扰[9]。因此，明确病原、建立有效检测方法对该病的防控有重要意义。目前，兔细菌性腹泻的研究主要涉及病原特性和防治措施，有关诊断方法相对较少[10]。传统病原菌分离鉴定方法费时耗力，成本较高，且易出现漏检，不能达到快速诊断的目的。本研究对重庆地区兔细菌性腹泻病原菌进行分离鉴定，并建立检测方法，为该病的防控奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 试 剂

细菌基因组提取试剂盒、2×TaqPCR Master Mix、DL2000 DNA marker、胶回收试剂盒和胎牛血清均购自天根生化科技(北京)有限公司；参照文献[11]的细菌16S rDNA基因序列通用引物，同时，参照铜绿假单胞菌外毒素eta基因[12]、产气荚膜梭菌a毒素基因[13]、金黄色葡萄球菌耐热核酸酶nuc基因[14]和大肠杆菌外膜蛋白eae基因[15]设计特异性引物，引物均由上海生工生物工程有限公司合成，引物信息见表1。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.2 菌 株

链球菌(CVCC1887)、多杀性巴氏杆菌(HN13)和沙门氏菌(ATCC 25922)参考菌株均由重庆市畜牧科学院兽医兽药研究所提供。

1.3 病例来源

重庆市各区、县兔场腹泻病例的兔粪便或肠道内容物。

1.4 方 法

1.4.1 病原菌分离培养及致病性分析 对疑似感染病例临床诊断后，采集病料，利用划线法接种于含有φ=10%胎牛血清的TSA固体培养基，于37 ℃恒温培养箱中培养，用生理盐水将分离到的各疑似病原菌菌液稀释为108cfu·mL-1，通过腹腔注射8只小鼠，每只0.2 mL，并设对照组，正常饲喂7 d后进行致病性分析，并从死亡小鼠心血或肝脏中进行病原菌的分离纯化。同时，对分离到的疑似菌株进行革兰氏染色鉴定。

1.4.2 16S rDNA基因序列扩增及系统进化树构建 参照细菌基因组提取试剂盒说明书提取分离菌总DNA，利用细菌通用引物扩增各分离菌株16S rDNA基因序列，反应体系为：DNA模板3 μL，上下游引物各0.2 μL，2×TaqPCR Master Mix 25 μL，ddH2O 21.6 μL。反应条件：95 ℃预变性5 min；94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，30个循环；72 ℃延伸10 min，PCR产物送上海生工生物工程有限公司进行测序。将测序结果在NCBI 中BLAST比对分析，并借助MEGA 5.0软件，利用N-J法构建系统进化树。

1.4.3 多重PCR检测条件优化 参照“1.4.2”对各菌株特异性引物进行鉴定，PCR产物送上海生工生物工程有限公司测序分析。挑取各病原菌单菌落接种于含φ=10%胎牛血清的TSB培养液，37 ℃培养24 h，用生理盐水将各菌株稀释为108cfu·mL-1，提取基因组后，各取2 μL混匀作为模板进行多重PCR反应，参照文献[11]的方法分别针对引物浓度和退火温度进行多重PCR反应条件的优化，上下游引物均以0.1 μmol·L-1为浓度梯度，范围均为0.1～0.5 μmol·L-1，退火温度以2 ℃为梯度，范围为50 ℃～60 ℃。

1.4.4 多重PCR引物特异性分析 分别提取参考菌株和病原菌株基因组DNA，利用多重PCR最适反应条件扩增目的基因，进行引物特异性分析。

1.4.5 多重PCR反应灵敏度分析 制备108cfu·mL-1各病原菌菌液，10倍梯度稀释后，选取浓度为 101～105cfu·mL-1，提取不同浓度病原菌基因组DNA，同一浓度各取2 μL为模板，利用多重PCR最适反应条件进行灵敏度分析。

1.4.6 临床样品检测 利用建立的多重PCR反应条件对临床采集的样本进行兔腹泻病原菌鉴定，并对病原菌多样性及流行情况进行分析。

2 结果与分析

2.1 临床症状

通过对患病兔的临床诊断，发现腹泻病例多为幼兔，腹泻程度不尽相同(图1)，且多数病例肠道出血较为严重，肠黏膜出现脱落现象(图2)。

2.2 细菌分离及致病性试验

通过细菌分离培养共分离到4种疑似病原菌。小鼠攻毒试验发现，接种12 h后，各试验组部分小鼠开始出现精神萎靡、采食和饮水减少、蜷缩不动病症，24 h后开始出现死亡，7 d 后，发现4 种分离菌均可引起小鼠死亡，死亡率分别为60%、80%、100%和50%，且从各死亡小鼠的心血和肝脏中均分离到目的菌株。经革兰氏染色发现3株为杆状或短杆菌，1 株为球菌，2 株为G+菌(图3-B、3-C)，2株为G-菌(图3-A、3-D)。

2.3 基于16S rDNA的分离菌系统进化树分析

利用通用引物扩增各分离菌株16S rDNA基因序列，Blast比对发现4种菌株分别与铜绿假单胞菌、产气荚膜梭菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌同源性较高，均高于99%，且在系统进化树分析中也分别与其聚为一簇(图4)。

图1 腹泻幼兔Fig.1 Diarrhea of young rabbit

图2 肠道病变Fig.2 Intestinal lesion

A～D：细菌分离株1～4(1 000×) Bacterial strain 1-4(1 000×)

图4 基于16S rDNA基因序列构建的系统进化树Fig.4 Phylogenetic tree based on 16S rDNA gene sequences

2.4 多重PCR反应条件的优化

通过对各菌株特异性引物鉴定，发现均能有效扩增出目的条带。多重PCR反应条件优化结果显示：引物浓度≥0.2 μmol·L-1时，鉴定效果较好(图5)，退火温度≥58 ℃时效果较好(图6)，确定0.2 μmol·L-1为最适引物浓度，58 ℃为最适退火温度。

M.DL2000 marker；1～5. 0.1-0.5 μmol·L-1

M.DL2000 marker；1～6. 50 ℃～60 ℃

2.5 多重PCR检测的特异性分析

通过对多重PCR引物特异性鉴定，发现各引物仅在有病原菌基因组的情况下可扩增出单一特异性条带，产物大小与预期结果一致。链球菌、多杀性巴氏杆菌和沙门氏菌均无扩增条带(图7)。

2.6 多重PCR检测方法灵敏度分析

通过多重PCR反应体系灵敏度检测，发现各菌株浓度≥103cfu·mL-1时，扩增效果较好，故该方法的最低检出浓度为103cfu·mL-1(图8)。

M.DL2000 marker；1.链球菌 Streptococcus;2.多杀性巴氏杆菌 P.multocida；3.沙门氏菌 S.enterica；4.金黄色葡萄球菌 S.aureus；5.铜绿假单胞菌 P.aeruginosa；6.产气荚膜梭菌 C.perfringens；7.大肠杆菌 E.coli

2.7 临床样品检测

利用建立的检测方法，对临床采集的200份兔腹泻样品进行检测，发现混合感染样品检出率为37%，单一病原菌感染样品检出率为63%。其中，金黄色葡萄球菌单独感染检出率高达37.6%，铜绿假单胞菌和产气荚膜梭菌单独感染检出率较低，分别为6.5%和5.0%；混合感染样品中，金黄色葡萄球菌和大肠杆菌混合感染检出率最高(28.0%)，未发现铜绿假单胞菌和产气荚膜梭菌以及4种病原菌同时感染的样品，其他病原菌混合感染检出率均较低(图9)。

M.DL2000 marker；1～5.101～105 cfu·mL-1

3 讨 论

随着养兔业的不断发展，兔疫病防控问题已成为主要制约因素。在饲养管理不当、养殖技术水平低的情况下，兔感染病原菌几率会显著提高[16]。兔细菌性腹泻无明显的季节性，以冬春季节最易流行，发病率和死亡率均较高，多个品种均易发生。此外，兔腹泻病因复杂，种类多样，而针对兔细菌性腹泻的疫苗又相对较少，故快速有效的检测方法显得尤为重要[17]。传统的病原菌分离培养方法虽然能达到疫病诊断目的，但对试验设备、人员操作和病料采集等方面要求较高[18]。不同病原菌对培养条件的需求往往不一致，当病料中存在多个病原菌时，若在同一条件下进行培养，会出现病原菌间竞争效应，导致培养条件需求较高的病原菌难以分离，给疫病诊断带来困扰[19]。随着PCR技术在多个领域的应用，凭借高特异性、高灵敏性、操作简单等优势，在疫病诊断方面发挥重要作用。多重PCR技术，不仅具有普通PCR优势，并能同时对多个目的基因进行检测，在检测混合感染方面具有显著优势[11]。

图9 临床样本的多重PCR检测结果统计Fig.9 Multiple PCR test results of clinical samples

目前，关于兔细菌、病毒和寄生虫等感染引起的疫病检测研究较多，而混合感染检测方法相对较少。感染兔的病原菌种类较多，且易与其他病原菌、病毒和寄生虫发生混合感染，给兔健康养殖带来严重威胁。本研究通过对重庆地区兔腹泻临床样品检测发现，建立的多重PCR检测方法能有效针对铜绿假单胞菌、产气荚膜梭菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌对兔的感染情况进行诊断，可以通过1次操作实现对病原菌单一或混合感染情况的快速诊断。检测结果表明，单一病原菌引起的兔腹泻病例较多，金黄色葡萄球菌检出率最高，与陈艳会等[20]对葡萄球菌的临床分离鉴定结果相一致；混合感染多为2种病原菌引起，金黄色葡萄球菌和大肠杆菌混合感染最为严重，未检出铜绿假单胞菌与产气荚膜梭菌的混合感染，且未出现4种病原菌同时感染的情况。各病原菌临床检出率差别较大，其中，金黄色葡萄球菌单独感染检出率为37.6%，混合感染样品中金黄色葡萄球菌检出率为81.1%；大肠杆菌单独检出率仅为14%，而混合感染样品中大肠杆菌检出率高达100%，表明其最易与其他病原菌混合感染，这可能与部分大肠杆菌具有条件致病性有关。

兔细菌性腹泻病原检测常采用细菌分离培养技术与分子诊断技术相结合的方法，虽能达到对病原菌鉴定的目的，但耗时较长，对于培养条件要求较高的菌常出现漏检现象，造成检测结果误判，且对多个病原菌混合感染的情况不能达到快速诊断的目的，给疫病防控带来一定的困扰[19]。本研究建立的多重PCR检测方法操作简便，成本低且灵敏度高，给重庆地区兔细菌性腹泻的检测提供理论依据，也为该病的防控奠定基础。