利福昔明子宫注入剂含量测定及方法耐用性试验研究

蒋玲玉，黄慧丽，李秀波，徐 飞

(中国农业科学院饲料研究所，国家饲料药物基准实验室，北京 100081)

奶牛子宫内膜炎是降低奶牛繁殖能力和生产性能的重要疾病之一[1]，发病率高，诱发母牛不孕症，经济损失严重[2]。该病的主要病原菌为链球菌和葡萄球菌[3-5]，目前临床上多采用抗生素治疗，且主要以全身用药为主。利福昔明(Rifaximin)是一种半合成的利福霉素类衍生物，抗菌谱广，抗菌能力强[6]，对葡萄球菌和链球菌具有较好的活性[7]。且具有以下几个优点：①该药作用迅速，临床症状减退快。②该药在体内不易被吸收，局部使用可形成较高的血药浓度，其他组织分布较少，不易产生动物性食品药物残留[8]。③安全性较好，无致畸性、致突变性、致癌性以及生殖毒性[9]。根据利福昔明的作用特点和在奶牛养殖业的需要，近年来利福昔明在兽医临床疾病(特别是奶牛疾病)的防治中也越来越受到关注。意大利FATRO公司研发生产的利福昔明子宫用产品，2010年以来，陆续在以色列、意大利、波兰和捷克等国家批准上市，商品名为FATROXIMIN®，但目前该产品尚未在中国注册。国内，齐鲁动物保健品有限公司于2014年批准了利福昔明乳房注入剂，商品名为齐利宁®[10]，目前我国尚没有自己生产的利福昔明子宫注入剂。

为保障药物的安全性和有效性，本研究建立了准确灵敏的利福昔明子宫注入剂HPLC含量测定方法并进行了不同检测波长、流速及柱温等色谱条件的耐用性试验验证其可靠性，最终对制剂中利福昔明的含量进行测定。

1 材料与方法

1.1 仪器及试剂 高效液相色谱仪(Waters 2695)，美国Waters公司；数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；电子分析天平，德国Sartorius公司；涡动装置，美国Scientific industry公司；超纯水装置，美国Milli-Q公司；高速离心机，美国Thermo Fisher公司；手可调移液器，德国Eppendorf公司；酸度计(PB-21)，德国Sartorius公司；隔膜真空泵，天津市腾达过滤器件厂；溶剂微孔过滤膜(直径47 mm，0.45 μm)，美国Pall公司；针筒式微孔滤膜过滤器(直径13 mm，0.45μm)，天津博纳艾杰尔科技有限公司；色谱柱(WondaSil C18-WR 250mm×4.6 mm，5 μm)，日本岛津公司。奶牛用利福昔明子宫注入剂(含量187.5 mg/25 g/支)，中国农业科学院饲料研究所国家饲料药物基准实验室自主研发；利福昔明对照品(含量95.7%，批号130542-200601)，购自中国药品生物制品检定所；利福昔明原料药(含量98.1%，批号80621-91-4)，购自浙江思贤制药有限公司；乙腈、甲醇均为色谱级纯，购自美国Fisher公司；甲酸铵、浓氨水均为色谱级纯，购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 色谱条件 流动相：V(甲醇)∶V(乙腈)∶V(3.16 g/L甲酸铵，浓氨水调pH至7.2)= 31.5∶31.5∶37；流速：1.4 mL/min；柱温：40 ℃；进样量：20 μL；检测波长：276 nm。

1.3 样品前处理 供试品工作液的配制：精密称取摇匀后的利福昔明子宫注入剂4 g(相当于利福昔明30 mg)，精密加入乙腈30 mL，涡旋0.5 min，用锡纸封口，置于25 ℃超声仪器中超声30 min左右，4000 r/min离心5 min后精密取上清液5 mL，用流动相定容至50 mL，摇匀，即得100 μg/mL的供试品工作液。

对照品工作液的配制：精密称取利福昔明对照品10.45 mg(相当于利福昔明10 mg)，将称量的对照品转移至100 mL棕色容量瓶中，再用流动相溶解稀释，定容，制备成100 μg/mL的对照品工作液。分别取适量并用流动相稀释为40 μg/mL的工作液，进样20 μL至液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算。

1.4 参数考察和方法耐用性试验 参照《中国兽药典》，对线性范围、灵敏度、准确度及精密度进行了考察，并对方法耐用性试验进行研究。

2 结果与分析

2.1 供试品及对照品色谱图 如图1 所示。 供试品与对照品的保留时间分别为8.52 min和8.47 min，分离度分别为16.79和16.49，能与杂质很好的分离，含量为98%，主峰尖锐且对称。

2.2 线性范围 精密称取利福昔明对照品适量，用流动相配制成浓度分别为40、50、80、100、120、150 μg/mL的溶液。按1.2项下的色谱条件进样，记录色谱图，按外标法计算利福昔明峰面积，以利福昔明峰面积为纵坐标(Y)，进样浓度(X，μg/mL)为横坐标，绘制标准曲线，求出相关系数r=0.9995，结果表明利福昔明在40～150 μg/mL浓度范围内线性关系良好。利福昔明标准曲线如图2所示。

图1 利福昔明色谱图(a 对照品；b 供试品)Fig 1 Rifaximin chromatogram(a reference substance;b sample)

图2 利福昔明标准曲线Fig 2 The calibration curve of rifaximin

2.3 灵敏度 采用逐步稀释的方法，按信噪比S/N≥3计算，检测限LOD值为0.25 μg/mL，按信噪比S/N≥10计算，定量限LOQ值为0.6 μg/mL。

2.4 准确度 取原料药适量(187.5mg:152.90mg、187.5mg:191.13mg、187.5mg:229.36mg)，即按照利福昔明子宫注入剂处方以及浓度比例和原料药的含量，理论上分别称取152.90、191.13、229.36 mg，按照1.3项下所示方法配制成高、中、低三个浓度的样品，即按照日内测5次，日间测5次，平均回收率分别为99.88%、99.51%、99.59%，日间变异系数分别为0.6%、0.74%、0.7%。准确度(回收率)试验结果如表1所示。

表1 准确度(回收率)试验结果Tab 1 The result of accuracy(recovery)

2.5 精密度 精密称取同一批样品6份，按照1.3项下方法处理样品，以1.2色谱条件进样检测，样品含量峰面积平均值为993352.5，RSD=0.13%。精密度(重复性)试验结果如表2所示。

表2 精密度(重复性)试验结果Tab 2 The result of precision(repeatability)

2.6 耐用性试验——检测波长考察 参照《中国兽药典》(2015年版)要求，对色谱条件进行耐用性试验研究，设定变动范围检测波长为271～281 nm、流速0.8～1.7 mL/min、柱温25～42 ℃，并设定梯度。取供试品及对照品适量，并配制成浓度为40 μg/mL的工作溶液，各取20 μL，按1.2项下色谱条件，依照表3改变检测波长，连续进样2针，在设定检测波长275 nm上下波动，含量测定RSD为1.73%，无明显影响，分离度符合要求，说明检测波长在271～281 nm之间能准确的测定其含量。结果如表3所示。

2.7 耐用性试验——检测流速考察 取供试品及对照品适量并配制成浓度为40 μg/mL的工作溶液，色谱条件参照1.2项，在不同流速条件下，连续进样2针，结果显示，RSD=0.50%，对测定结果无明显影响，分离度符合要求，说明检测流速在0.8～1.6 mL/min之间能准确的测定其含量。检测流速的考察结果如表4所示。

表3 检测波长的考察结果Tab 3 The result of detection wavelength

表4 检测流速的考察结果Tab 4 The result of flow rate

2.8 耐用性试验——检测柱温考察 取供试品及对照品并稀释成浓度为40 μg/mL的工作溶液，色谱条件参照1.2项，在不同柱温条件下，连续进样2针，结果显示RSD=0.84%，对测定结果无明显影响，分离度符合要求，说明检测柱温在25～40 ℃之间能准确的测定其含量(表5)。

表5 检测柱温的考察结果Tab 5 The result of column temperature

2.9 样品含量测定 取利福昔明子宫注入剂三批(20141004，20141005，20141006)，按1.3项下方法配制供试品工作液，以1.2项色谱条件进样检测，3批样品的含量分别为102.0%、99.8%、100.6%。

3 讨论与结论

3.1 样品前处理方法的优化 对样品进行前处理的作用主要是除去样品中的蛋白质和脂肪等物质，以避免大分子与利福昔明形成牢固的共价键而无法分开。目前，在很多化学药物残留检测前处理方法中，使用有机酸溶液(如酸化乙腈、三氯乙酸)或纯有机溶剂(如甲醇、乙腈)使蛋白质变形可以除去样品中的蛋白，然后加入正己烷等有机溶剂，除去脂肪物质。

为了使提取效果最优化，比较了乙腈、甲醇及流动相的提取效果，结果显示，使用同为有机溶剂的乙腈与甲醇，后者的提取效果远远不如前者；乙腈和流动相相比，乙腈的回收率略高于流动相的10%，参照孙雷等[11]在样品的前处理方法最终决定使用乙腈作为提取液。

3.2 耐用性试验 耐用性是指在测定条件有小的变动时，测定结果不受其影响的承受程度，为所建立的方法用于日常检验提供依据。方法耐用性试验是考察检测方法可靠性的非常重要的内容。在耐用性试验研究中，第一次实验，设流速梯度为0.8、1.0、1.2、1.4 mL/min，RSD=3.48%，柱温梯度为30、35、40、45 ℃，RSD=3.99%，故选择将梯度设为流速上下浮动1 mL/min、柱温上下浮动2 ℃，说明梯度变化过大对方法的稳定性有一定的影响，因此，在实际含量测定过程中，这两个高效液相色谱参数要特别注意，避免对实验结果产生影响。

本文建立了HPLC法测定利福昔明子宫注入剂中主成分利福昔明的含量。结果表明，在40～150 μg/mL浓度范围内线性关系良好(r=0.9995)，检测限(LOD)为0.25 μg/mL，定量限(LOQ)为0.6 μg/mL。以80、100、120 μg/mL三个浓度水平进行添加回收，回收率在98.26%～101.12%之间，日内变异系数在0.17%～1.13%之间，日间变异系数<0.73%。耐用性研究表明，在测试范围内，检测波长、流速、柱温对含量测定无明显影响(RSD<2.0%)且分离度符合要求。三批制剂样品经测定后，含量分别为102.0%、99.8%、100.6%。本研究建立的利福昔明子宫注入剂含量方法操作简便、方法准确灵敏且可靠性高，可以用作该制剂的质量控制。