快速钝化玉米热带亚热带种质光敏性方法及其育种利用研究

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(北京市农林科学院玉米研究中心/玉米 DNA 指纹及分子育种北京市重点实验室, 北京 100097)

玉米是世界上最重要的粮食作物之一，提高玉米产量和改良玉米品质，一直是全世界玉米育种工作者研究的重要课题。发展至今，我国玉米种植面积和总产量仅次于美国，居世界第 2 位,2015年种植面积达到0.38 亿hm2，总产达到2.24亿t，面积和总产均列农作物第1位，玉米成为中国第一大作物[1]。在玉米单产增长的诸因素中，遗传改良的作用占35%～40%[2]。玉米是利用杂种优势最早并且取得成效最显著、也是种子市场价值最高的作物之一。优异丰富的玉米种质资源是玉米品种选育的物质基础。对我国玉米种质遗传基础分析表明，种质相对高度集中，遗传基础趋于狭窄[3-4]，增加了玉米品种遭受病虫侵害的风险性，相近的亲缘关系使其基因利用潜力受到限制，成为产量提高、品质改善以及抗性增强的主要障碍[5]。实践表明，玉米的种质创新对玉米突破性新品种培育起到了巨大的支撑作用[6]，如著名的拉美玉米计划(LAMP)和美国玉米种质创新计划(GEM)。国际玉米小麦改良中心(CIMMYT)贯彻“通过利用保存资源”的理念，构建具有不同目的(熟期、籽粒颜色、籽粒类型等)的广基群体，应用改良穗行半同胞方法进行改良，再应用相互轮回选择等方法提高一般配合力[7]，开展玉米种质创新。

玉米在长期的自然选择和人工选择下演化出多样的生理种族和生态群，构成了丰富的遗传多样性宝库。利用热带亚热带种质改良和拓宽现有种质基础已是世界各国玉米育种者的共识[5]。热带亚热带玉米种质来自于玉米多样性中心，具有不同于温带种质的遗传变异，表现出根系发达、茎秆坚韧、叶片浓绿、持绿期长、多数对病虫害具有较强抗性，一些种质抗倒伏和耐旱性较强等优点[8]，与温带种质遗传差异大，多数表现出较高的杂种优势[9]。但由于热带、亚热带玉米类型一般都具有很强的光敏感(周期)反应，在温带地区表现抽雄吐丝延迟、雌雄不协调、营养生长旺盛、植株高大、空杆率高、结实率差，有些甚至不能开花结实进行繁殖，难以直接利用[10]。为此，开展了利用和导入热带亚热带种质的方法研究，提出了在相似生态环境直接利用、在过渡地区选择逐步驯化或者温带地区混合选择、采用单交、三交、回交和复合杂交等多种方法将热带、亚热带种质导入到温带种质、构建温带热带复合群体进行相互轮回选择等利用途径[4,11-12]，利用选育了一批优良自交系，并用这些自交系配制了一批优良杂交种，在各地推广应用。这些方法驯化过程缓慢，需要时间长，且无法完全排除供体的残余种质、效率较低。因此，亟需一种快速钝化热带亚热带玉米种质光敏性的方法，获得在温带地区可以使用的玉米新种质。

玉米DH(Doubled Haploid)育种技术作为现代玉米育种三大核心技术之一[13-14]，以生物杂交诱导获得受体(基础材料)材料的单倍体，经过自然或人工处理使单倍体染色体加倍，2个世代就获得遗传上纯合的自交系(DH系)，将自交系选育周期由7～8代缩短为2代，大幅度缩短育种年限，提高育种效率，已经得到国内外种业公司的规模化应用。

依据玉米热带亚热带种质利用实践情况，结合DH育种技术，进行了快速钝化热带、亚热带光敏性的方法进行研究，得到了一种结合冬季南繁和DH育种技术、经南北不同区域种植、2年4个世代就可以将热带亚热带种质导入温带种质进行利用的方法(专利申请号20171038579.1)，实践证明此方法切实可行有效。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选用玉米自交系材料PH 4 CV为受体，以玉米热带种质材料Suwan 1为供体。

1.2 试验方法

2009年10月在海南种植受体材料PH 4 CV 和热带种质Suwan 1，组配杂交种子F1。成熟收获后，混合脱粒，作为选系基础材料。

2010年5月在北京以4 000株/667 m2的密度种植F1作为受体材料，并种植玉米单倍体诱导系京科诱044作为父本进行杂交。为保证花期相遇，诱导系分二期种植。成熟后，收获杂交果穗，并依据籽粒胚和胚乳顶端紫色标记甄别，挑选出籽粒顶端紫色、胚无色籽粒为拟单倍体籽粒。

2010年10月在海南将拟单倍体籽粒单粒播种，拔节后依据植株颜色、长势等淘汰杂合植株，开花期及时认真检查单倍体植株花药显露和花粉散粉情况，进行自交，成熟后及时收获结实果穗(DH系)。

2011年5月在北京种植DH纯系进行鉴定与扩繁。将倒伏10%以上以及产生光敏反应的开花延迟、雌雄不调、不能自交的纯系淘汰，及时自交。成熟后，再将有大斑病、小斑病、茎腐病、穗腐病等严重病害以及结实性极差(小于50粒)的纯系淘汰，收获自交结实50粒以上的DH纯系。

2011年10月在海南种植DH纯系，幼苗期利用DNA分子标记辅助育种技术进行纯合度鉴定，建立DNA指纹图谱，分析DH纯系与现有骨干自交系的遗传距离和杂优类群，同时进行扩繁，用自交系PH 6 WC进行测配。

2012年5月，将组配杂交组合种植在黑龙江、辽宁、吉林、内蒙古、北京、山西、河北、河南、山东、陕西等不同生态区进行鉴定。选择对茎腐病、穗粒腐病、大斑病、小斑病等主要病害达到中抗以上级别抗性、倒伏率低于10%、空杆率为3%以下、产量高于对照等综合农艺性状优良的杂交组合，其对应的DH系即为含有热带种质能在温带利用的新种质。

表1 含热带种质的玉米优良DH系测配组合表现情况(2012年)

组合地点小区产量(kg)比相邻对照增产(%)PH6WC×H121919小汤山8.0212.4铁岭10.1715.6梨树9.6812.8郑州7.588.9PH6WC×H121949小汤山7.6310.3铁岭9.7812.2梨树8.4911.8郑州7.769.5PH6WC×H122005小汤山7.467.8铁岭8.238.6梨树7.256.3郑州6.625.8

2 结果与分析

2.1 快速创制含有玉米热带亚热带种质DH系

2009年冬季获得PH 4 CV×Suwan 1杂交组合，2010年春季种植作为基础材料，以诱导系京科诱044杂交诱导，通过籽粒标记鉴别获得拟单倍体籽粒1 100粒，2010年冬季在海南种植鉴定，经自然加倍获得加倍DH系112份。2011年春季在北京种植鉴定与扩繁，淘汰产生光敏反应的开花延迟、雌雄不调、不能自交、严重病害、结实性差的纯系，收获优良DH纯系20份。2011年冬季在海南种植20份DH系，幼苗期提取叶片DNA，利用SSR分子标记技术进行纯合度鉴定，建立DNA指纹图谱，分析DH纯系与现有骨干自交系的遗传距离和杂优类群，用自交系PH 6 WC进行测配。2012年春、夏季将组配杂交组合种植在黑龙江、辽宁、吉林、内蒙古、北京、山西、河北、河南、山东、陕西等进行鉴定。结合田间表现和抗性调查，鉴定筛选出产量高于对照等综合农艺性状优良的杂交组合PH 6 WC×H 121919、PH 6 WC×H 121949、PH 6 WC×H 122005(见表1)，其对应的纯系定名为京SV 19、京SV 49、京SV 05，为含有热带种质能在温带利用的新种质(图1)。

图1 导入热带种质的玉米DH系植株(京SV 19和京SV 49单株与群体)

图2 第二轮含有热带种质玉米DH系(果穗)

通过南北不同区域种植，从构建基础材料到得到DH系仅用了2年4个世代，而且得到的DH系含有热带亚热带种质，可以直接用于玉米新品种育种，或者作为新材料加入到玉米育种项目中。京SV 19、京SV 49已经申请植物新品种权 (申请号分别为20160068.7、 20160069.6，见图1)。

2.2 含有热带亚热带种质DH系的利用

为充分挖掘新种质京SV 19、京SV 49、京SV 05配合力特性与利用潜力，于2013年、2014年与多个自交系进行大范围测定与鉴定，筛选优良杂交组合。其中选用杂交组合京X 005×京SV 19(京科青贮649)参加了2015年北京春播青贮玉米试验，结果平均生物产量为1 432 kg/667 m2，比对照农大108增产4.5%，且纤维品质一级，具有较高的稳产性和抗倒伏能力，并被推荐参加国家2016年青贮玉米区试，申报并获得植物新品种权(CNA 20150630.7)。在黄淮海区域试验中，2016年遇到高温，部分试验地点出现空杆，该组合没有晋级试验。

针对现有杂交组合存在不足，确定将不同新种质携带的优良基因进行聚合，为此，2015年春季在北京将京SV 19与京SV 49进行杂交获得杂交种子，2015年冬季在海南对杂交F1进行诱导获得单倍体籽粒，2016年春季在张掖种植加倍获得DH系162个(第二轮含有热带亚热带种质的玉米DH系)，并于2016冬季在海南进行扩繁鉴定与测配，2017年春夏季对测配组合进行多点种植鉴定。经田间调查与收获测产相结合，筛选出30多个优良组合，这些组合所对应的优良新DH系10多个，如B 160957、B 163200、B 163211、B 163333、B 163462、B 163478、B 163501、B 163666等(图2)。这批玉米DH系含有热带种质，在温带地区种质完全没有光敏反应，植株中等，抗倒性强，持绿性好，果穗结实性好，将用于组配选育新组合，或与温带骨干自交系杂交组建基础材料进行自交系选育。

3 讨论与结论

热带、亚热带玉米种质与温带玉米种质遗传基础差异较大，利用热带、亚热带玉米种质不但可以增强温带玉米种质在抗病、抗逆、优良农艺性状等方面的特性，还可以拓宽温带玉米种质的遗传多样性。引进热带、亚热带种质并对其进行鉴定、改良，拓宽我国玉米种质基础是育种者的共识，并得到实施取得不少成效[11]。在具体利用方式和途径方面做了很多研究，提出了不少方法、途径，但均表明热带亚热带玉米种质利用是一个需要长时间的缓慢过程[4，11，15]。

随着细胞工程技术、染色体技术、分子标记技术、转基因技术及基因编辑等现代技术的出现与应用，常规育种技术得到补充，育种效率将显著提高。玉米生物杂交诱导DH 育种技术以其特有优势已经得到规模化应用[14]。本研究以温带玉米材料为受体、热带种质为供体，开展快速钝化热带亚热带玉米种质光敏性研究。结果表明，以温热杂交组合作为基础材料，利用冬季南繁，结合玉米DH 育种技术，经南北不同区域、2年4个世代就得到在温带地区可以种植利用的含有热带亚热带种质的玉米DH系，既可以直接进行优良玉米新品种选育，也可以作为新材料加入到原有玉米种质材料，拓宽玉米种质基础，选育新的优良自交系。此方法解决了快速钝化热带亚热带玉米种质光敏性的问题，切实可行有效，将加快我国热带亚热带玉米种质的利用进程。