铬-铜复合胁迫对凤仙花种子萌发及幼苗生长的影响

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(佳木斯大学生命科学学院， 黑龙江 佳木斯 154007)

重金属污染已经成为当今世界上危害严重的污染之一。重金属主要通过采矿、电镀、油漆等工业而排出，进而间接或直接地对植物造成危害，严重影响人类健康[1]。铜是一种有毒的重金属元素，而且还是环境中最主要的重金属污染物。在植物生长发育过程中铜是必需的营养元素之一，但过多的铜可以抑制植物光合作用，且引起叶色失绿，从而抑制植物生长。铬不仅是环境当中广泛存在于的“五毒”元素之一，还是一种有毒、致畸和致突变的元素。土壤中共存的铬和铜对土壤-植物生态系统的影响已经得到越来越多的研究人员关注[2-4]。植物修复具有很多优点，是重金属污染修复的一种切实有效方法。因此寻找到既能对重金属具有积累又具有抗性能力的植物，无疑对受污染土壤的修复具有重要意义。用凤仙花作研究对象，研究重金属铬和铜复合胁迫对其种子萌发及生理指标的影响，既可以避免生物体误食保证生物体安全，又可以作为观赏植物美化环境，同时也为重金属污染土壤的植物修复提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

凤仙花种子来自于佳木斯市西林种子公司。重金属添加形式为硫酸铜和氯化铬。

1.2 水培设计

挑选饱满均匀的凤仙花种子，将种子浸于浓度为0.4%的高锰酸钾溶液里消毒15 min，取出后用蒸馏水反复冲洗干净，再用不同浓度的Cr-Cu混合溶液浸泡种子2 h。取玻璃培养皿并在每个培养皿中垫2张滤纸，将不同浓度的Cr-Cu混合溶液加入培养皿中，在每个培养皿中均匀放入50粒凤仙花种子，对照组采用蒸馏水培养。每处理均为3次重复，共7个处理，Cr-Cu复合处理及对照组浓度见表1。为了使种子处于湿润状态，在培养皿种子的上方铺2层纱布(生根后取出)。之后把培养皿置于光照培养箱内，每天添加相应浓度的Cr-Cu溶液或蒸馏水，保持每皿相应的浓度。在第5天测定发芽率、叶绿素含量、根系脱氢酶活力以及超氧化物歧化酶活性等指标。

表1 Cr-Cu处理浓度

处理Cr3+(mg/L)Cu2+(mg/L)10022010340204804051608063201607640320

1.3 叶绿素含量测定

叶绿素含量测定采用比色法[5]。从各处理组幼苗上分别取0.1 g叶片，用剪刀剪碎后放入研钵中，加入2～3 mL 95%乙醇溶液、少量碳酸钙粉和石英砂研磨到组织变白匀浆，停止，放置5 min。过滤提取液到10 mL试管中，之后用少许乙醇冲洗残渣、研棒及研钵数次并过滤干净，用乙醇定容至10 mL，摇匀。将叶绿素提取液倒入光径1 cm的比色杯内，空白对照用95%乙醇，在波长为645 nm、663 nm下测定吸光度，计算叶绿素的含量。

1.4 根系活力测定

根系活力测定采用四氮唑(TTC)法[6]。称量各处理组根尖0.5 g，置于烧杯中，并加入磷酸缓冲液和0.4%TTC溶液的等量混合液10 mL，把根完全浸入溶液中，置于37 ℃黑暗条件下保温1～3 h，取出后往烧杯中倒入2 mL的1 mol/L硫酸，使反应停止(同时做一个空白试验)。取出根之后，把根表面的水分吸干后放入研钵，并在钵内加入少量石英砂及3～4 mL乙酸乙酯一起研磨，提取出三苯基甲腙。之后把提取出的红色液体转移到试管中，将残渣用少许乙酸乙酯洗涤2～3次，一并转入试管中，最终用乙酸乙酯定容至10 mL。以空白试验作参照，用分光光度计测量在波长485 nm下吸光度，测定3次，查标准曲线，即可求出TTC还原量，计算出根系活力。

1.5 超氧化物歧化酶活性的测定

超氧化物歧化酶(SOD)活性测定采用邻苯三酚自氧化法[7]。取10μL的50 mmol/L邻苯三酚，充分摇匀，以缓冲液做空白对照，每30 s测定1次吸光度。在相同条件下加入10μL待测SOD液，读取其吸光度。

1.6 数据分析

利用SPSS 16.0统计软件对试验数据进行单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 铬和铜对凤仙花种子萌发的影响

发芽率可以反映出种子的出苗情况。不同浓度Cr-Cu复合溶液对凤仙花种子的发芽率有一定影响。如图1，当Cr-Cu处理浓度在(80，40)mg/L以下时，与对照组相比，凤仙花种子的发芽率呈上升趋势，这表明在低浓度范围内Cr-Cu溶液对凤仙花种子的发芽有一定的促进作用。当处理浓度达到(160，80)mg/L时，发芽率开始下降，但与对照组相比差异不显著(p>0.05)。随着Cr-Cu浓度的进一步增高，种子发芽率明显下降，与对照组差异显著(p<0.05)，说明Cr-Cu复合胁迫对凤仙花萌发产生了抑制作用。

注：不同字母表示差异达显著水平(p<0.05)。图1 不同浓度铬和铜对凤仙花种子发芽率的影响

2.2 铬和铜对凤仙花幼苗叶绿素含量的影响

叶绿素与植物的光合作用有十分重要的关系，其含量在一定程度上决定同化物质的能力。从表2可以看出，随着Cr-Cu复合胁迫浓度的增加，叶绿素a、叶绿素b以及叶绿素总含量都呈先增加后下降的趋势，在(80，40)mg/L处理下达到最高，在(640，320)mg/L处理下最低(低于对照组)。表明低浓度的胁迫对叶绿体的合成具有促进作用，随着胁迫浓度的增大，重金属的毒害作用就会显现出来，从而阻碍叶绿素的合成，影响植物的光合作用。同时还发现在Cr-Cu处理浓度范围内叶绿素a/b比值是一直下降的，且叶绿素a含量的降幅大于同组叶绿素b的降幅，表明叶绿素a比叶绿素b更容易受到Cr-Cu复合胁迫的影响。

表2 不同浓度铬和铜对凤仙花幼苗叶绿素含量、根系活力和SOD的影响

Cr-Cu浓度(mg/L)叶绿素a(mg/g)叶绿素b(mg/g)叶绿素a+b(mg/g)叶绿素a/b根系活力[μg/(g·h)]SOD(U/g)(0,0)10.68±0.89a4.31±0.23a14.99±1.12a2.4854.6±1.43a260±6.76a(20,10)10.93±0.91a4.64±0.27ab15.57±1.23b2.3653.0±1.65a285±7.34a(40,20)11.21±0.86b4.85±0.32b16.06±1.16c2.3150.4±3.23a330±8.96b(80,40)11.56±0.73c5.02±0.35b16.58±1.08d2.3046.8±2.98a360±11.23c(160,80)10.98±0.65ad4.98±0.28b15.96±0.91c2.2040.2±2.31b390±9.45d(320,160)10.12±0.57e4.80±0.29c14.92±0.86a2.1137.6±2.73b350±10.67e(640,320)8.46±0.49f4.29±0.19d12.75±0.68e1.9732.6±1.76c310±12.00e

2.3 铬和铜对凤仙花幼苗根系活力的影响

根系活力是衡量根系生长质量的重要指标。根系活力越高，则根系组织的代谢就越旺盛，植株生长状况就越好。因为根部是接触重金属的直接部位，所以重金属很容易影响植物的根系活力。由表2可知，凤仙花幼苗在所有Cr-Cu处理浓度范围内根系活力随浓度增加而下降。Cr-Cu在(80，40)mg/L以下处理浓度，与对照组相比幼苗的根系活力没有出现明显的差异，说明这一浓度以下的Cr-Cu对凤仙花幼苗的生长没有太大的影响，不产生毒害作用。随着Cr-Cu浓度高于(160，80)mg/L处理，凤仙花幼苗的根系活力明显下降，说明从此浓度开始产生了毒害作用，且Cr-Cu的浓度越高对幼苗的毒害作用越重。

2.4 铬和铜对凤仙花超氧化物歧化酶活性的影响

超氧化物歧化酶在植物呼吸代谢过程中起着非常重要的作用，其活性是监测植物受重金属毒害的重要生理指标。从表2可以看出，当Cr-Cu复合胁迫浓度在(20，10)mg/L时，其SOD的活性与对照组相比有所增加，但不显著。随着Cr-Cu复合胁迫浓度的不断增加，SOD的活性显著增加，当浓度达到(160，80)mg/L时，SOD的活性最大。当浓度达到(320，160)mg/L以上时，SOD的活性有所下降，但比对照组高。因此，高浓度的Cr-Cu对凤仙花幼苗的生长具有抑制作用。

3 结论与讨论

在重金属胁迫下，萌发期和苗期植物生长的变化通常被作为评价植物重金属忍耐度的重要指标[8]。试验结果表明，较低浓度的Cr-Cu复合胁迫对凤仙花种子萌发起到一定刺激作用，而高浓度起到抑制效应，随着胁迫浓度的增加，对凤仙花种子萌发的抑制作用加剧，这与以前的研究结果一致[9]。导致种子萌发率低促高抑现象的原因可能是低浓度Cr-Cu可增加胚的生理活性，促进种子萌发；而高浓度Cr-Cu对胚、芽等产生了伤害作用，抑制了种子内贮藏蛋白质和淀粉的分解，从而影响种子萌发所需的物质和能量，导致种子萌发率下降[10]。

绿色植物进行光合作用主要靠叶绿素，含量高说明植物生长状况好、光合作用强。试验中，Cr-Cu在(80，40)mg/L的浓度以下进行处理，叶绿素a、叶绿素b、叶绿素总含量有上升趋势，表明Cr-Cu复合胁迫使凤仙花幼苗具有一定的防御性，低浓度刺激使叶绿素含量增加，这可能与凤仙花本身的抗性机制有关，细胞内的金属蛋白结合了外来的有毒金属离子，导致重金属离子的毒害作用被解除。提高Cr-Cu的处理浓度，重金属的毒害作用就会显现出来，其原因可能是Cr-Cu与相关酶相互作用，阻碍了叶绿素前体的合成，导致叶绿素分解，或直接破坏叶绿体结构阻碍叶绿素合成，导致叶绿素含量降低。有的研究认为，叶片衰老的过程伴随着叶绿素a/b值同时下降[11]，试验中叶绿素a/b值随处理浓度的升高而下降，表明Cr-Cu复合胁迫使叶片加速衰老。

随着Cr-Cu胁迫浓度的增加对凤仙花幼苗根系活力的影响表现为逐渐下降，浓度越高，下降幅度越大。这个结果与镉对烤烟幼苗根系活力的影响相一致[12]。其原因在于重金属胁迫下产生的自由基超过植物本身抗氧化系统酶的清除能力，过量的自由基会破坏根系代谢中的琥珀酸脱氢酶活性，从而降低根系活力。

在不同浓度Cr-Cu胁迫下，SOD活性先升高后下降。SOD是植物体内清除活性氧自由基的重要酶，低浓度Cr-Cu能提高幼苗SOD的活性，使植物体清除自由基的能力加强，从而防止植物细胞中毒，表现为SOD活性上升。在高浓度Cr-Cu处理后使超氧自由基数量超过凤仙花的耐受极限，使SOD活性受到抑制。

凤仙花对铬和铜具有一定的抗性，利用凤仙花对受重金属污染的土壤进行修复时需考虑铬和铜的治理效率问题。由于铬和铜胁迫对凤仙花生长发育的影响是多方面的，具体的机制还有待于进一步探讨。