四川南充地区1 056例地中海贫血初筛阳性样本的基因诊断结果分析

杜利君，邢晏，蒋兴亮，张兵，李欣， 杨杉，赵佳，何玉霞

(1.川北医学院第二临床学院·南充市中心医院检验科；2.西华师范大学数学与信息学院；3.川北医学院附属医院检验科，四川 南充 637000)

地中海贫血(thalassemia，地贫)，是由于基因缺陷引起珠蛋白合成缺乏或不足而导致的一种慢性溶血性贫血，属于常染色体不完全显性遗传性疾病，以α、β-地贫最多见。不同地区、不同种族人群地贫基因的发生频率、基因类型和分布特征具有明显的差异，主要在地中海的中部、东部、东南亚地区流行，中国大陆主要分布在广东、广西、海南以及周边省份，如湖南、福建、四川、云南、贵州等地区[1]。地贫轻型可无临床表现，但重型可致残、致死，严重威胁着人类的生命健康。因此，了解本地区人群的地贫基因突变类型和分布特征是预防及避免重型地贫患儿出生的工作重点。目前，各地关于地贫的基因类型和分布情况均有研究和分析，但四川南充地区地贫相关报道较少，故现对2015年7月至2017年7月在南充市中心医院检测的1 056例地中海贫血基因诊断结果进行分析，以了解南充地区人群中α、β-地中海贫血的基因类型和分布情况，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 研究对象

2015年7月至2017年7月在本院进行地中海贫血基因检测的人员，患者的住址为南充地区覆盖的三区、六县，排除其它市区就诊人员；且受检者红细胞平均体积(MCV)<80 fl和(或)红细胞平均血红蛋白(MCH)<27 pg，且已排除缺铁性贫血的高度可疑地贫人群。其中，男性369例，女性687例；年龄1 d～81岁，平均年龄(22±16)岁；按年龄分为儿童组(0～17岁)324例，青中年组(18～50岁)648例，老年组(>50岁)84例。

1.2 主要仪器和试剂

Life Express Thermal Cycler PCR仪由杭州生物科技有限责任公司提供，HB-2012A核酸分子杂交仪，α、β地中海贫血基因检测试剂盒(PCR+导流杂交法)由广东凯普生物科技股份有限公司提供，检测人抗凝静脉血样本中3种缺失型α-地贫(--SEA、-α3.7和-α4.2)、3种突变型α-地贫(CS、QS、WS)及β-地贫的17种突变位点CD17(A→T)、CD41-42(-TCTT)、IVS-II-654(C→T)、-28(A→G)、-29(A→G)、CD43(G→T)、CD14-15(+G)、CD71-72(+A)、CD27-28(+C)、CD31(-C)、IVSI-1(G→A/T)、IVSI-5(G→C)、βE3(G→A)、CAP(A→C或-AAAC)、Int(T→G)、-30(T→C)、-32(C→A)。

1.3 检测方法

1.3.1 DNA分离提取 采用凯普血液基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)，严格按照说明书提取样本DNA。

1.3.2 PCR扩增 将α、β PCR mix与Taq酶按要求混匀后，取45 μL分装到0.2 mL PCR管中；向已分装反应液的PCR管中加入5 μL DNA模板，瞬时离心后，上机扩增。

1.3.3 扩增产物的导流杂交 严格按照凯普的杂交试剂盒说明书进行检测。

1.3.4 结果判断 根据试剂盒提供的地贫基因检测结果分析图比较分析判断结果。

1.3.5 质量控制方案 地贫基因反向斑点杂交膜条可同时检测3种α地贫缺失型基因(SEA、3.7、4.2)、3种突变型基因(CS、QS、WS)及17种常见β地贫突变型基因。(1)室内质控：杂交膜上有3个α和6个β正常对照点，每次实验所有正常对照点均应显色，突变纯合子及缺失纯合子除外，否则需重新提取DNA、PCR扩增、杂交。同时，为排除实验过程出现污染，防止假阳性结果出现，使用蒸馏水作阴性质控，全程参与提取、扩增、杂交，阴性质控结果无任何杂交点，视为实验过程无污染。此外，将已知地贫型别的阳性标本按照检测样本量分装保存于-70 ℃，实验时与检测标本同步处理，全程参与提取、扩增、杂交，得到已知的地贫型别，视为该批地贫结果在控、可靠。(2)室间质评：本实验室每年参加了卫生部组织的地中海贫血基因分型检测的室间质评，成绩均为100%。

1.4 统计学分析

数据采用SPSS 21.0软件进行统计学分析，检出率比较用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 四川南充地区人群的地贫基因诊断结果

经多聚酶链扩增(GAP-PCR)技术和DNA芯片反向斑点杂交检测技术，在1 056例地中海贫血基因检测样本中，共检出α、β-地贫330例，检出率为31.3%。其中，α-地贫168例(15.9%)，β-地贫161例(15.3%)，αβ复合突变1例(0.1%)。

2.1.1 α地贫基因类型及构成比 在330例确诊地贫样本中α-地贫168例，构成比为50.9%，包含6种亚型：--SEA/αα、-α4.2/αα、-α3.7/αα、-ααCS/αα、-ααQS/αα、--SEA/-a3.7。其中以--SEA/αα(72.6%)、-α3.7/αα(17.9%)为主，占α-地贫的90.5%。α-地贫的基因诊断结果及临床分型的详细情况(表1)。

2.1.2 β地贫基因类型及构成比 在330例地贫确诊样本中检出β-地贫161例，构成比为48.8%，有以下6种类型：CD17、CD41-42、-28、-29、IVS-II 654、CD41-42/-29，其中最常见的3种突变类型为：CD17(50.3%)、CD41-42(31.1%)及IVS-II 654(14.3%)，占β-地贫的95.7%。β-地贫基因型及构成比详细情况(表2)。

2.1.3 α复合β地贫基因类型 330例地贫患者中有1例α复合β-地贫，所占比例为0.3%，基因型为-α3.7/αα复合βIVS-II-654M，临床表现为轻型。

表1 168例患者α-地贫基因型及构成比

表2 161例患者β-地贫基因型及构成比

2.2 患者地贫基因诊断结果比较

1 056例受检者中，男性369例，检出地贫90例(24.4%)，女性687例，检出地贫240例(34.9%)，女性地贫基因检出率明显高于男性，差异具有统计学意义(χ2=12.423，P=0.001)；男性检出α-地贫48例(13.0%)，女性检出α-地贫120例(17.5%)，男女α-地贫检出率无统计学差异(χ2=3.568，P=0.059)；男性β-地贫检出42例(11.4%)，明显低于女性119例(17.3%)，差异具有统计学意义(χ2=6.554，P=0.010)。男女α、β-地贫基因诊断情况(表3)。

2.3 各年龄组地贫基因诊断结果比较

1 056例样本中，儿童组(0～17岁)324例，检出地贫93例(28.7%)；青中年组(18～50岁)648例，检出地贫213例(32.8%)；老年组(>50岁)84例，检出地贫24例(28.6%)。各年龄组地贫基因检出率差异无统计学意义(χ2=2.050，P=0.359)(表4)。

表3 患者α、β-地贫基因诊断结果

表4 各年龄组α、β-地贫基因诊断结果

3 讨论

地中海贫血是我国南方地区最常见的遗传性疾病之一，临床以α和β地中海贫血较为常见。根据其基因型及临床症状分为轻型、中间型和重型[1]。目前，中重症地中海贫血的治疗较困难，主要有输血、造血干细胞移植和基因治疗等方式，给家庭和社会带来了沉重的负担。地贫虽然难治但可以预防，因此，了解本地区人群的地贫基因突变类型和分布特征率是预防及避免中重型地贫患儿出生的工作重点，对地贫的防治具有重要意义。

在本研究纳入的1 056例地贫基因受检者中，携带者330例，检出率为31.3%，明显高于成都[2]、遂宁[3]、泸州[4]等四川其它地区，可能与研究纳入的对象和数量有一定的关系。本研究纳入的1 056例受检者，其红细胞平均体积(MCV)<80 fl和(或)红细胞平均血红蛋白(MCH)<27 pg，且已排除缺铁性贫血的高度可疑地贫人群，因此可能增加了本地区的地贫检出率，提示南充地区可能属于地贫高发地区之一，应进一步加强地中海贫血的筛查和基因诊断。在330例地贫患者中，α地贫患者168例(15.9%)，以--SEA/αα(72.6%)、-α3.7/αα(17.9%)为主，占α-地贫的90.5%。其α地贫基因型分布与广东、广西、湖南、四川、重庆等地区人群基本一致[5-7]。另外β地贫检出161例(15.3%)，以CD17(50.3%)、CD41-42(31.1%)及IVS-II 654(14.3%)，为主，占β地贫的95.7% ，与重庆、四川地区的β地贫主要基因突变类型一致[7-8]。但广东、广西地区的β地贫以CD41-42(-TCTT)为主[5,9]，提示不同地域、不同人群的β地贫基因突变类型存在差异。此外，本研究还检出αβ复合地中海贫血1例(0.1%)。研究表明，αβ复合突变的患者临床症状有所减轻，但若其与α地贫或β地贫婚配，均有可能生育中型和重型地贫患儿[10]。因此，若夫妻中任意一方为αβ复合突变时，另一方需检测α和β地贫基因，以减少或避免生育中型和重型地贫患儿。此外，该检测方法尚存在一定的局限性，实验中检测的3个a缺失、3个a突变以及17个b突变位点，为临床最常见地贫类型，覆盖95%以上地贫类型，但地贫基因的突变类型较多，无法完全覆盖，可能存在少见地贫类型的漏检。

在受检人群中，女性的地贫检出率为34.9%，明显高于男性地贫检出率为24.4%，与自贡[11]、黔东南州[12]等地区研究基本一致，但与重庆[13]地区男、女地贫检出率存在差异。地贫以预防为主，尤其是对育龄夫妇的预防显得尤为重要。本研究纳入的育龄女性占有较大比例，若育龄夫妻中的女方是地贫携带者，部分男性若血液学指标MCV>80 fl和MCH>27 pg，则未进行地贫基因的检测，有可能存在漏检的情况；亦有部分夫妻，即便女方为地贫携带者，而男方由于各种原因未接受地贫的相关检查，此外，随着二胎政策的出台以及临床医护人员不断加大地贫知识地宣传力度，孕妇增加了安全意识及对地贫的重视程度，进行地贫基因检测的孕妇也相应增多。以上均是造成女性检出率高于男性检出率的重要因素。同时，亦不能排除因为样本含量较小造成的性别差异。虽然各年龄组的地贫基因检出率未发现差异，但由于二胎政策的开放，青中年为生育年龄的集中段，所以加大对青中年人群，尤其是育龄夫妇的地贫筛查和基因诊断力度，对提高人口素质具有重要作用。

综上，南充地区是地中海贫血高发地区之一，α地贫以--SEA/αα缺失最常见，β地贫以CD17最常见，CD41-42次之，具有明显的地域差异。通过对南充地区地贫基因突变类型和分布特征的研究，为南充地区制定地贫防治计划、开展临床咨询、干预出生缺陷以及临床诊疗提供参考依据。