长链非编码RNA PlncRNA-1在前列腺癌中的表达及其意义

黄勇，闫骏

(内蒙古医科大学附属医院泌尿外科，内蒙古 呼和浩特 010059)

前列腺癌是男性泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一[1]。长链非编码RNA(lncRNA)是一类长度介于200 nt-100 kb之间的非编码RNA，主要位于细胞核与细胞质中，可在真核细胞中普遍被转录[2-3]。目前研究[4]发现，lncRNA参与了包括基因转录调控、介导染色质重建及组蛋白修饰等一系列重要的细胞活动。新近有研究[5]发现一种新的lncRNA与包括前列腺癌等多种恶性肿瘤性疾病的发病有关，该lncRNA被称为PlncRNA-1。笔者通过对前列腺癌患者病理标本及前列腺癌标准细胞株中PlncRNA-1的表达及其在疾病发病中的可能机制进行了相关研究，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 材料

人前列腺癌细胞株LNCaP购自上海细胞库； RNA反转录试剂、siRNA转染试剂购自TaKaRa公司，siRNA由上海吉凯基因化学技术有限公司合成；鼠抗人CyclinD1及β-actin抗体均购自Santa Cruz公司；Trizol、Lipofectamine2000试剂购自Invitrogen公司；PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 组织标本

所有组织标本均来源于内蒙古医科大学附属医院接受手术切除的患者，术后病理证实为前列腺癌者12例(Pca组)，另选择12例良性前列腺增生标本为对照组(BHP组)。所有患者均签署知情同意书，相关内容获医学伦理委员会批准。

1.3 干扰PlncRNA-1的siRNA等引物的设计与合成

PlncRNA-1干扰序列及对照序列均由上海吉凯基因化学技术有限公司合成，具体序列如表1所示。

表1 PlncRNA-1干扰序列及对照序列

1.4 细胞培养及转染

LNCaP细胞的培养条件：采用含100 ml/L胎牛血清的1640培养基，置于37℃、5% CO2细胞培养箱中培养。

细胞转染：当LNCaP细胞汇合度达到约80%后，通过Lipofectamine2000介导的方法将将siRNA转入细胞中，具体操作步骤详见说明书。根据转染与否将细胞分别命名为PlncRNA-1-siRNA组、对照组(NC组)。

1.5 PlncRNA-1 mRNA水平的检测

收集待测细胞，参考试剂说明书提取细胞总RNA，并反转录为cDNA，以此cDNA为模板，扩增目的基因。PlncRNA-1、内参照β-actin引物序列如表2。qRT-PCR反应条件为：95 ℃ 3 min，95 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，共40个循环，实验重复3次。

表2 PlncRNA-1及β-actin引物序列

1.6 Cyclin D1蛋白水平的检测

收集经转染PlncRNA-1-siRNA组、NC组 48 h后，采用PBS溶液洗涤2次(每次间隔5 min)，离心后弃上清，随后加入50 μL细胞裂解液，冰上裂解30 min以充分裂解细胞后，在12 000 rmp下离心15 min(4 ℃)，取其上清。加入上样缓冲液，经100 ℃(5 min)变性后用100 g/L的SDS-PAGE分离，转移至NC膜。用含50 g/L脱脂奶粉封闭1 h(20 ℃)。分别加入Cyclin D1 (1∶1000)、β-actin(1∶3000)一抗，4 ℃条件下孵育过夜后，采用TBST洗涤3次(每次间隔5 min)。随即加入二抗(1∶3000)并于室温下孵育1 h，TBST洗涤3次。然后分别加入A、B显色剂1 min显色观察。

1.7 CCK-8法检测细胞增殖速率

分别取第1、2、3、4、5天 PincRNA-1-siRNA组、NC组细胞以2×106/mL接种于96孔培养板中，平行接种两组，每个实验条件设3个复孔，每孔100 μL培养体系。在37 ℃、5%CO2培养箱培养24 h后，一组每孔分别加入10 μL的CCK-8试剂，培养箱中孵育1 h，酶联仪检测细胞的450 nm处吸光度值。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 PlncRNA-1在肿瘤组织中的表达

本组资料共收集前列腺癌(Pca)患者标本组织12例及正常前列腺增生(BHP)组织12例。两组患者在年龄分布上未见统计学差异。通过qRT-PCR方法检测两组组织中PlncRNA-1 mRNA水平。观察发现，前列腺癌患者组织标本中PlncRNA-1 mRNA表达水平(2.48±0.37)，较正常前列腺组织(1.19±0.28)显著升高，差异有统计学意义(P=0.031)，见图1。

2.2 PlncRNA-1在PlncRNA-1-siRNA组及NC组细胞中的差异表达

对比发现，经siRNA下调细胞株中PlncRNA-1，其PlncRNA-1 mRNA相对表达量为(1.43±0.69)，较NC组细胞株(2.54±0.41)明显降低，差异有统计学意义(P=0.028)，见图2。

2.3 下调PlncRNA-1对LNCaP细胞内周期蛋白Cyclin D1表达的影响

采用Western Blot方法检测两组细胞株中细胞周期蛋白Cyclin D1表达水平，观察发现，经siRNA下调PlncRNA后，其细胞内Cyclin D1蛋白水平(1.13±0.22)显著低于对照组的(0.34±0.18)，差异有统计学意义(P<0.05)，见图3。

2.4 下调PlncRNA-1对LNCaP细胞增值速率的影响

采用CCK-8法检测PlncRNA-1-siRNA组、NC组细胞增殖速率间差异发现，PlncRNA-1下调后，LNCaP细胞株的增殖速率显著下降，在第5天时最为明显，与同时点NC组细胞组相比，差异有统计学意义(P<0.05)，见图4。

3 讨论

前列腺癌是男性泌尿系统最为常见的恶性肿瘤之一，近年来其发病率有增高趋势，严重威胁人群健康[6]。此前认为，前列腺癌是一种雄激素依赖性肿瘤，然而随着近年来的研究发现，其往往表现为较强的异质性[7-9]。这表明，在前列腺癌发病过程中，有着除雄激素以外其他因素的参与。生命活动的调控都是由生物体内遗传物质——基因决定的。在通过对人类在内的多种生物体基因组研究过程中发现，绝大部分基因并没有转录为特定的蛋白质分子参与生命活动，更多是参与转录基因的表达调控过程，这其中就包括非编码RNA[10]。目前针对非编码RNA的研究逐渐成为热点，也让人们逐渐认识到这些为转录的基因分子在生命活动中的重要性。长链非编码RNA(lncRNA)是一类长度介于200 nt-100 kb的非编码RNA，主要位于细胞核与细胞质中，可在真核细胞中普遍被转录。与mRNA相比，lncRNA分子结构上没有典型的开放阅读框，无法编码或很少编码相应的蛋白质分子[11-12]。新近研究发现，这些lncRNA分子在胚胎发育过程中具有激活细胞全能性的特点，对细胞周期具有显著的调节作用[13-14]。

PlncRNA-1被认为与前列腺癌有着密切相关性，前期相关研究[15-16]发现，在前列腺癌标本中，能够检测到较高水平的PlncRNA-1表达。在本研究中也发现了一致的结果。无论在前列腺癌患者病变组织标本中，亦或是前列腺癌细胞株中，PlncRNA-1 mRNA的表达水平均明显增高，表明PlncRNA-1在前列腺癌发病中起到了积极作用。然而对于升高的具体意义，目前暂无统一认识。本组研究中，通过比较观察PlncRNA-1对前列腺癌细胞株细胞周期的影响试图探讨其可能的作用机制。笔者通过siRNA技术干扰肿瘤细胞株内PlncRNA-1的表达，检测其对细胞周期蛋白Cyclin D1表达水平的影响，观察发现，与未处理的细胞株(NC组)相比，PlncRNA-1下调的细胞株中，Cyclin D1蛋白表达水平显著下降，而Cyclin D1蛋白是参与细胞增殖的重要蛋白，其水平的增高可促进细胞的增殖。这表明，PlncRNA-1具有促进Cyclin D1蛋白表达的作用，这也进一步表明其具有促进细胞增殖的作用。进一步研究发现，与NC组细胞株相比，PlncRNA-1下调后细胞株其细胞增殖速率显著降低，这也再次表明，PlncRNA-1对前列腺癌细胞具有显著的促增殖作用。

综上所述，长链非编码RNA PlncRNA-1的高表达参与了前列腺癌的发病过程，促进细胞周期蛋白Cyclin D1的表达从而促进肿瘤细胞增殖可能是其参与发病的机制之一。然而，受样本数量等客观因素的限制，数据偏倚在所难免，今后将扩大样本量进一步深入研究与上、下游相关分子的相关性，以期更进一步明了PlncRNA-1的具体机制。