山东地区屠宰场猪肉污染沙门氏菌菌株毒力基因筛查与ERIC-PCR分型

黄秀梅,张 倩,盖文燕,曲志娜,李晨阳,赵思俊,赵建梅,赵 格,李月华,王玉东,王君玮,王 娟

沙门氏菌是一种重要的肠道致病菌,主要通过污染的动物性食品感染人类,导致食物中毒、肠伤寒、尿毒症等,严重时可导致死亡[1].我国70%～80%的细菌性食物中毒是由沙门氏菌引起的[2],主要是因为摄入了受污染的食物和水,其中畜禽产品也是沙门氏菌主要的载体;尽管生猪在养殖过程中不易受到沙门氏菌的感染,而在屠宰加工过程中由于操作、环境等方面的因素,容易受到沙门氏菌引起的交叉污染.目前已确认的血清型有2 600多种[3],其中有的血清型对人有很强的致病性,同时毒力因子(如脂多糖、肠毒素、细胞毒素以及毒力蛋白等)的存在与相互作用也是导致其致病的重要原因[4],严重威胁人类健康.研究山东地区生猪屠宰场中不同环节猪肉污染沙门氏菌血清型、基因型和毒力基因携带情况进行对猪肉产品中沙门氏菌预警和危害控制具有重要意义.

本研究通过对山东省内多家生猪屠宰加工企业生产链中胴体表面、设备及环境等进行沙门氏菌检测、血清型鉴定和毒力因子筛查,并对分离菌株进行ERIC-PCR分型,旨在了解猪肉在屠宰加工过程中沙门氏菌的污染状况及其溯源性追踪,从而分析沙门氏菌污染的关键环节,为生猪屠宰加工过程中沙门氏菌污染的有效防控提供科学依据,对猪肉产品的安全具有重要意义.

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株来源 肠炎沙门氏菌CICC21482为阳性对照菌株,大肠杆菌ATCC25922为阴性对照菌株,均有中国动物卫生与流行病学中心实验室保存.

1.1.2 主要试剂与仪器 缓冲蛋白胨水(BPW)、四硫磺酸钠煌绿增菌液基础(TTB)、胰蛋白大豆肉汤、细菌琼脂粉、MH肉汤均购自北京陆桥生物技术有限公司,沙门氏菌显色培养基(法国科马嘉),Go-Taq Green Master Mix酶,DNA Marker、PCR反应试剂均购自Ta KaRa公司,沙门氏菌血清型快速分型试剂盒(x MAP Salmonella Serotyping Assay RUO Kit)购自美国Luminex公司生物安全柜(美国NUAIRE)、电热恒温培养箱(美国NUAIRE)、PCR仪(美国BIO-RAD)、电泳仪(北京六一仪器厂)、GelDocXR凝胶成像分析仪(美国BIO-RAD)、Luminex 200液相芯片分析仪(美国Luminex)

1.1.3 引物 所有引物均由上海生物工程技术有限公司合成.

1.2 方 法

1.2.1 样品来源 2015年采自山东不同地区规模生猪屠宰场屠宰环节猪肉和环境棉拭子样品共1 480份.

1.2.2 细菌分离鉴定 按照 GB 4789.4-2016方法进行沙门氏菌分离,并挑取单个可疑菌落煮沸法提取DNA,利用保守基因inv A引物(上游:5′-GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA-3′;下 游:5′-TCATCGCACCGTCAAAGGAACC-3′),以可疑菌落DNA为模板,用PCR方法对筛选的可疑菌落进行基因水平鉴定,产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳和凝胶成像,在284 bp位置有条带的细菌即为沙门氏菌.

1.2.3 x MAP液相芯片法分型 利用沙门氏菌血清型快速分型试剂盒和Luminex 200液相芯片分析仪进行沙门氏菌的血清分型,能够准确鉴定出目前所有常见的沙门氏菌血清型,该方法虽然成本较高但方便快捷,准确率高.

1.2.4 毒力基因检测 参考文献[5-8]发表的沙门菌 mog A、sse L、mgtC、bcf A、ara B、spv A、spv B、spvC、spv D、spvR、hisJ、fliC、stn、fim A 毒 力 基 因序列,设计合成14对沙门菌毒力基因扩增引物,见表1.

表1 毒力基因引物序列Tab.1 Primers sequence of virulence genes

表1 (续)

挑取适量过夜培养的菌落于1 m L灭菌超纯水中,涡旋均匀后,12 000r/min离心5 min,弃上清后加500μL灭菌超纯水混匀后置于沸水浴中10 min,取出立即冰浴10 min,12 000 r/min离心10 min,取上清即为PCR模板,备用,以大肠杆菌标准菌株(ATCC25922)作为阴性对照、肠炎沙门氏菌标准菌株(ATCC13076)作为阳性对照.

PCR反应参数:5种毒力岛核心蛋白基因mog A、sseL、mgtC、bcf A、araB 的反应参数为:95℃预变性5 min,94℃变性30 s,Tm退火30 s,72℃延伸30 s,共进行30个循环,最后72℃延伸10 min,4℃保存.

5种毒力质粒基因spv A、spv B、spvC、spv D、spv R的反应参数:95℃预变性5 min,94℃变性30 s,Tm退火30 s,72℃延伸30 s,共进行35个循环,最后72℃延伸10 min,4℃保存.

其余4种毒力因子基因hisJ、fliC、stn、fim A的反应参数:95℃预变性5 min,94℃变性45 s,Tm退火30 s,72℃延伸30 s,共进行35个循环,最后72℃延伸10 min,4℃保存.

每个样品取7μL扩增产物于1.2%的琼脂糖凝胶中进行电泳,DL2000 DNA Marker作为参照,140V恒压电泳30 min,电泳结束后用凝胶成像仪进行成像分析,记录结果.

1.2.5 ERIC-PCR分子分型 引物序列:AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG.反应体系与参数:ERIC-PCR方法反应体系为25μL,Go Taq○RGreen Master Mix 12.5μL,Nuclease-Free Water 9.5μL,ERIC引物1μL,核酸模板2μL.反应程序,94℃预变性5 min,94℃变性1 min,52℃退火1 min,72℃延伸3 min,循环35次,最后72℃延伸10 min,4℃保存.扩增产物于1.2%的琼脂糖凝胶中进行电泳,电压140V电泳25 min,结束后用凝胶成像系统处理图像.

2 结 果

2.1 分离鉴定 对2015年采集自山东不同地区规模生猪屠宰场屠宰环节1 480份棉拭子进行沙门氏菌分离鉴定后,共得到298株沙门氏菌菌株,分离率为20.14%.

图1 部分疑似沙门氏菌PCR产物电泳图Fig.1 Suspected salmonella strains electrophoresis results

2.2 x MAP液相芯片法分型 298株分离菌共分为9种血清型,检出率较高2种主要血清型分别为德尔卑沙门氏菌(78株)、鼠伤寒沙门氏菌(59株),其次是汤普逊沙门氏菌(45株)、阿贡纳沙门氏菌(40株)、肠炎沙门氏菌(25株)、罗米他沙门氏菌(18株)、策维埃沙门氏菌(15株)、拉古什沙门氏菌(12株)、奥里塔蔓林沙门氏菌(6株).不同屠宰环节沙门氏菌血清型不同.详见表2.

2.3 毒力基因检测 对298株分离沙门氏菌中14对毒力基因进行检测发现,除毒力基因spv B未被检出外,其余毒力基因均有检出.其中,所有分离株均携带毒力岛SPI3和SPI4的核心蛋白mgtC、bcf A基因;98.32%的分离菌株携带肠毒素stn基因;毒力岛SPI1、SPI5核心蛋白基因mog A、ara B以及菌毛基因的携带率,分别为97.99%、97.99%以及96.64%.详见表3.

表2 不同屠宰环节血清型个数统计结果Tab.2 Serotype results of different slaughter links

表3 生猪屠宰环节毒力基因检出数Tab.3 Detected number of virulence genes of pig slaughter links

图2 沙门氏菌分离株部分毒力基因PCR产物的电泳图Fig.2 Electrophoresis results of Salmonella strains virulence genes

图3 沙门氏菌分离株部分毒力基因PCR产物的电泳图Fig.3 Electrophoresis results of Salmonella strains virulence genes

2.4 代表菌株ERIC-PCR分型 山东省不同地区沙门氏菌的主要血清型不同,选择不同地区的主要血清型的沙门氏菌共26株菌,其包括A地区4株德尔卑、3株鼠伤寒和1株阿贡纳沙门氏菌,B地区3株汤普逊和1株拉古什沙门氏菌,C地区2株德尔卑、2株肠炎和1株阿贡纳沙门氏菌,D地区2株肠炎和1株阿贡纳沙门氏菌,E地区2株罗米他、1株策维埃和1株肠炎沙门氏菌,F地区1株阿贡纳纳和1株鼠伤寒沙门氏菌.来自不同地区的26株沙门氏菌遗传相似性在70%～100%之间,按90%的同源性可以分为9个基因型(Ⅰ～IX).Ⅰ类为主要基因型,共有8株,包括3个地区3种血清型.其中4株为德尔卑沙门氏菌,2株肠炎和2株汤普逊沙门氏菌.且剩余8个基因型主要为同一地区同一血清型的菌株.26株沙门氏菌的ERIC-PCR见图4、图5.

图4 26株沙门氏菌分离株ERIC-PCR指纹图谱Fig.4 ERIC-PCR fingerprints of 26 Salmonella isolates

图5 沙门氏菌分离株的遗传关系聚类树状图Fig.5 Genetic relationship of Salmonella isolates

3 讨 论

3.1 毒力基因检测 本研究中所鉴定出的德尔卑沙门氏菌,均携带stn、fim A、mog A、mgtC以及bcfA基因;所有携带毒力质粒基因沙门氏菌分离株血清型均为肠炎沙门氏菌,且肠炎沙门氏菌均检测到5种毒力岛基因;鼠伤寒沙门氏菌中80%均携带hisJ基因,需大量实验进一步证实鼠伤寒沙门氏菌与hisJ毒力基因是否具有一定的联系;汤普逊沙门氏菌血清型均检测出stn、fim A基因以及5种毒力岛基因,但是除未检测到毒力质粒基因去外,均未检测到hisJ以及fliC基因,同时,同实验者在关于鸡源毒力基因的检测研究中,也未检测到这两种毒力基因,因而需进一步研究其携带状况与沙门氏菌血清型的关系.本实验中其他血清型沙门氏菌菌株毒力基因检出情况没有一定的规律性,需进一步深入研究.

本实验中5种毒力岛核心蛋白基因检出率较高,大多数沙门氏菌均同时携带这5种毒力岛核心蛋白基因,需进一步研究其致病性是否一致,才能更深入的了解其作用机制;5种毒力质粒基因的检出率较低,分析可能是因为目前研究表明,毒力质粒基因仅存在于几种特定的沙门氏菌血清型[9],如肠炎沙门氏菌;鞭毛蛋白基因fliC检出率不高,但是同实验者对鸡源沙门氏菌毒力因子的检测中,均未检测出此种基因,分析其可能具有一定的宿主特异性[6],或是产生于特定的血清型,但是还需大量实验研究进一步确定;组氨酸转运基底蛋白hisJ检出率较高,但是对于hisJ的研究较少,fim A和stn的检出率较高,与王德宁[4]检出情况比较接近,初步表明猪源与鸡源沙门氏菌具有相同的菌毛和肠毒素基因,但是具体的致病机制及原理有待研究.同时表明猪源沙门氏菌对其有较高的携带率,因而本实验的沙门氏菌分离株具有很大的潜在危险性,值得重视,应采取措施控制沙门氏菌的污染,从而降低这种潜在的风险.

3.2 ERIC-PCR分型 山东省不同地区主要血清型的ERIC-PCR结果表明,山东省不同地区主要血清型之间存在相同的基因型,这可能与屠宰场中生猪的来源相同有关,山东省是养殖大省,生猪养殖量大,但养殖规模参差不齐,有些屠宰场具有固定的规模化养殖场,屠宰来源相对比较单一,而周边的中、小型养殖场送往同一大型屠宰场进行屠宰导致不同地区的沙门氏菌具有同一基因型.