腺病毒生产工艺改进

薛亮 王爱霞 归翔刚

摘 要 在293细胞培养体系中感染腺病毒后，继续保持培养液中一定浓度的葡萄糖提供碳源，以维持宿主细胞更好的生命状态，促进腺病毒的复制、装配、释放，达到提高单批次病毒生产的产量。在病毒活性比稳定的前提下，改进后病毒颗粒数（产量）有41.1%的提升。

关键词 293细胞 腺病毒 残糖控制

中图分类号：Q813.11 文献标志码：A 文章编号：1006-1533（2018）15-0072-03

Improvement of the process for adenovirus production

XUE liang*， WANG Aixiang， GUI Xianggang

（Shanghai Sunway Biotech Co.， Ltd.， Shanghai 201206， China）

ABSTRACT After infection of adenovirus in the 293 cell culture， a certain concentration of glucose was continuously supplied in the culture medium to maintain the host cell in a better growth condition so as to promote the replication， assembly and release of the adenovirus and to improve the yield of single-batch virus production. The number of virus particles （production） could be improved by 41.1% on the premise of a stable virus activity ratio.

KEY WORDS 293 cell； adenovirus； residual sugar control

随着生物制药的普及和发展，病毒活载体疫苗的研制成为基因工程疫苗研制的热点，其中，腺病毒由于具有独特的优势，成为疫苗载体应用中不可缺少部分[1]。腺病毒是无包膜的线性双链DNA病毒，在自然界广泛分布，对人致病性小，不诱导癌变，较为安全，不整合入细胞基因组，遗传毒性低，宿主范围广，转染效率高，易于制备、纯化[2]。并且，腺病毒因其宿主细胞广，繁殖滴度高，装载容量大，成为近年来病毒载体研究热点[3]。直接将腺病毒载体导入人体内表达目的基因，治疗恶性肿瘤、心血管疾病或一些遗传疾病已取得可喜进展[1]；利用腺病毒载体在包装细胞293中表达分泌性蛋白质，如蛋白酪氨酸激酶1C等亦成为生产重组蛋白的一条途径。因此，完善293细胞的大规模培养技术及腺病毒扩增技术具有越来越重要的市场意义[4]。腺病毒的生产以细胞感染病毒为分水岭可分为细胞培养和病毒培养2个阶段， 细胞感染病毒后，病毒的释放时机及收获等的生产工艺参数一直是业内关注的重点，而通过生产工艺的不断改进降本增效也已成为业内的共识。本研究主要探讨在细胞感染病毒后，在培养液中继续保持一定浓度的葡萄糖，从而达到提高单批次病毒生产产量。

1 材料与方法

1.1 材料

14 L CelliGen Plus生物反应器、Disk载体（NBS公司）；胎牛血清（美国Hyclone公司）；DMEM高、低糖培养基、胰蛋白酶（美國Gibco公司）；葡萄糖试剂盒（上海名典生物工程有限公司）；分光光度计（上海尤尼克仪器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 原生产工艺

采用CelliGen Plus的生物反应器系统及Disk载体（兜篮式载体贴壁培养方式）培养293细胞，上罐细胞总量大1×109个细胞，于37 ℃、搅拌转速120 r/min、通气量（混合气体总量）0.4 L/min、工作体积10 L、含10%胎牛血清的DMEM高糖培养液（葡萄糖含量4.5 g/L）培养， 24 h后开始用含10% 胎牛血清的DMEM高糖培养液灌注培养6～9 d（根据每批次的细胞状态而定），当体系内细胞量处于饱和状态（根据糖耗值判断），接入病毒感染活性浓度3.16×1011 TCID50/ml的腺病毒悬液50 ml。病毒感染8 h后恢复对培养体系的灌注，灌注用的培养液是含5%胎牛血清的DMEM高糖培养液，逐步降低灌注量，约48 h后采用含2% 胎牛血清的DMEM低糖培养液（葡萄糖含量含量1 g/L）灌注培养，72 h后检测体系内病毒颗粒数，当反应体系内腺病毒浓度达到1×1010 vp/ml时，开始连续收获系统内的灌注打出液（病毒液），灌注体积（收获量）是4 L/d，收获约4 d左右，当反应体系内的用氧量回复到初始状态（罐内无细胞生长迹象）时，终止培养。

感染病毒后每24 h检测系统内葡萄糖含量，发现在0～48 h内，由于用高糖培养液灌注，系统内残糖量在0.7 g/L左右，而48 h开始，用低糖培养液液灌注后，系统内的残糖量在0.05 g/L，甚至更低，处于无糖状态。

1.2.2 改进后生产工艺

细胞培养阶段按1.2.1中的工艺操作，病毒感染后，每24 h取样检测系统内葡萄糖含量，48～120 h期间，仍然使用DMEM高糖培养液灌注，该段培养过程中，控制系统内残糖在0.3～1.0 g/L左右。在培养的后期（120 h开始）可采用含2%胎牛血清的DMEM低糖培养液（葡萄糖含量1 g/L）灌注培养，直至培养终止。

1.3 检测方法

1）以培养过程中用氧量的比例（系统自带自动测定）来对比改进前后培养体系内相同时段内细胞的生长趋势。

2）用颗粒数检测和病毒活性检测（TCID50）来观察改进后单批次病毒的产量及活性变化[5]。

2 结果

生物反应器在灭菌后将通气量设定在0.4 L/min。当将系统溶氧值设定在50%时，系统会利用外接的空气、氧气、氮气自动调节系统内的溶氧状态，使之达到设定的溶氧值（50%）。由于内部没有细胞生长，达到平衡后，此时三种气体的用量占比（总流量是0.4 L/min）是固定值，正常情况下此时氧气用量是0，由空气和氮气相互混合控制体系内的溶氧值。当接种细胞后，随着细胞生长耗氧，氮气的用量逐步下降，遂开始用氧。由于系统内除293细胞外，没有其他生物体代谢耗氧，所以可通过氧气用量占比判断系统内细胞生长情况。用氧占比高表明系统内活细胞数量大；反之，系统内活细胞数量少。

用改进后的方法连续生产7批次，收集每批次感染病毒后系统每天的用氧情况，取均值，与之前生产的11个批次对应的数据比较（图1）。

结果表明，改进后的工艺从第4天开始，用氧量的下降趋势明显小于改进前，并且用氧量回归到系统生产前调试阶段时初始值的时间平均比改进前延后了24 h，表明在之后相同的培养时段，改进后系统内的活细胞数量多于改进前，并有延迟凋亡的迹象。

用改进后的方法连续生产7批次，与改进前生产的11个批次对比见表1。

改进后工艺生产的病毒颗粒数（产量）与改进前工艺相比有41.1%的提升，病毒活性比没有太大变化，表明新工艺可提高单批次的病毒产量，对病毒的活性没有影响。

3 分析与讨论

3.1 原工艺设计思路

原工艺制定受产品研发阶段的培养模式影响较大。

产品研发阶段，使用培养皿小试生产腺病毒。293细胞生长时期，用DMEM高糖（葡萄糖含量4.5 g/L）培养，细胞利用葡萄糖作为碳源，代谢产物为乳酸。而在293细胞感染病毒后，如继续使用DMEM高糖培养液，会造成细胞代谢旺盛，产生的酸性环境，从而导致病毒的衣壳发生裂解，对病毒的扩增及最终的活性起到负面作用[6]。

用以下两个小实验来了解293细胞糖代谢后的产酸情况及对病毒生产的影响。

1）在培养皿体系用DMEM高糖测试细胞生长后产酸结果：293细胞以1∶2传代，72 h培养（未感染病毒），代谢后的培养液检测，pH在6.85左右。

2） 对培养皿体系中的293细胞接入腺病毒时分别使用DMEM高糖（葡萄糖含量4.5 g/L）和DMEM低糖培养液（葡萄糖含量1 g/L），培养48 h以上，同时收获，分别检测pH、病毒颗粒数和活性（表2）。

表2所示，病毒培养阶段使用高糖培养液的培养环境产酸较多，而用高糖培养液培养对应的病毒颗粒数和活性都较低，所以在当初工艺设计时，感染病毒后改用DMEM低糖培养，通过减少碳源量降低乳酸代谢产物，避免过酸环境影响到病毒的产量，该设计不仅用于培养皿制备腺病毒，后来也应用于生物反应器的大规模病毒生产。

3.2 原工艺设计的合理性和局限性

1） 合理性 在培养皿培养过程中，除了少量的气体交换外，既没有其他营养物质的补充和交换，也没有酸碱调节体系，减少碳源似乎是降低体系内酸度的唯一方法。所以在一次性收获的培养皿制备中具有一定的合理性（可避免细胞过度产酸影响病毒产量）。

2） 局限性 但利用生物反应器大规模培养，细胞培养阶段和病毒扩增阶段都采用灌注培养方式（新鲜培养液pH在8.0～8.5间），并配有补碱（8%碳酸氢钠溶液）系统，两者都可以中和体系中（系统pH控制在7.0～7.4）的乳酸，所以这种设计意义不大，相反低糖环境易造成细胞低代谢水平会引起细胞过早凋亡，在连续收获的反应器体系中会影响病毒的产量。

3.3 讨论

从上述数据对来看，在大规模灌注培养腺病毒的工艺中，感染病毒后0～120 h之间系统内的含葡萄糖量（碳源）决定了这批次可有效用于腺病毒扩增的活细胞数量和生命状态，而这些与最终腺病毒的产量有着直接关系。细胞感染病毒后直径从15 mm增至17 mm。在感染8～48 h期间，细胞对葡萄糖的消耗以及乳酸的生成量均增加了30%～100%，氧气的消耗和三磷酸腺苷的生成也有类似的趋势。因此，在培养病毒阶段更要注意营养物质的适度补给，一方面及时补充葡萄糖，因为在病毒扩增过程中，一旦葡萄糖耗竭会导致病毒扩增的停止[7]。病毒从接入细胞培养系统后，要经过入侵细胞、细胞内复制（病毒蛋白外壳和病毒核酸）、细胞内装配和破裂宿主细胞等几个阶段，这个过程约48～72 h。如果在48～120 h内灌注1 g/L的低糖培养液，低碳源的环境加速了细胞的凋亡，降低了细胞内病毒复制、装配的成功率；而在48～120 h内依然灌注4.5 g/L的高糖培养液，改善系统内细胞代谢条件，维持细胞的生长状态，可为腺病毒的复制、装配提供更多的时间和稳定的宿主生长条件，从而提高病毒产量。

另外，CelliGen Plus生物反应器系统的特点是启动后，难以从系统中取样计算细胞量（打开罐体将会破坏无菌生长环境），因而培养过程中采用检测系统内葡萄糖含量值来判断细胞生长情况。尽管病毒感染时，病毒细胞数比值即感染复数（MOI）按1∶20估算，实际情况下仍有大量正常细胞未被感染[8-9]，所以感染病毒后继续保持系统内的含糖量有利于维持过量的细胞的状态，利用病毒的二次感染也是提高批次病毒产量的途径之一。

为了在病毒感染后对系统内的残糖控制在0.3～1 g/L的范围内，除了改用高糖培养液外，还在某些时段增加了灌注量，这也就相应增加了一些收获液的体积，从而增加了后期纯化的工作量，可考虑使用更高糖浓度的培养液或单独补糖来解决。

参考文献

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