皮质下缺血性血管病患者血清基质金属蛋白酶9水平的检测及其临床意义

倪明珠，余锋，王瑶，宋莉莉，刘文灿，徐文，王文静

本文创新点：

本文应用定量性评估量表评定皮质下缺血性血管病（SIVD）患者脑部损伤病变与血清基质金属蛋白酶9（MMP-9）的相关性。大量动物实验表明，MMP-9作为炎性因子在致缺血性脑白质病变（WML）中具有重要作用。本文通过对SIVD患者脑部病变与MMP-9进行分析，可能对早期诊断SIVD有一定帮助，并为临床干预提供新的方向。

皮质下缺血性血管病（subcortical ischemic vascular disease，SIVD）是由脑小血管病变导致的以皮质下多灶性腔隙性脑梗死（lacunar infarcts，LI）和弥漫性脑白质病变（white matter lesions，WML）为主要病理改变的一组疾病，临床上以认知功能障碍以及轻偏瘫、假性延髓性麻痹、步态异常、尿路症状、情绪改变等为主要表现［1-2］。尽管SIVD确切发病机制仍未阐明，但近年研究发现主要与神经炎症、血-脑脊液屏障的破坏等方面有关［3-5］。有研究表明，基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）通过参与神经炎性反应，降解细胞外基质（extracellular matrix，ECM），破坏血-脑脊液屏障的完整性，在小动脉硬化、急慢性缺血性脑损伤的过程中产生破坏作用［4-5］。由于血-脑脊液屏障的通透性增强，脑脊液中的MMP-9可到达循环血液［4］，因而可被检测到。目前关于血清MMP-9与SIVD关系的研究，国内外鲜有报道。因此，本研究旨在通过测定SIVD患者血清MMP-9的表达水平，从而探讨其临床意义，以期为新的治疗方法提供参考依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象 SIVD纳入标准参照ERKIINJUNTTI［1］提出的诊断标准并加以修订：（1）年龄50～85岁；（2）颅脑磁共振成像（MRI）检查T2、FLAIR成像提示广泛的脑室旁和深部白质高信号（Fazekas评分［6］≥2级）和/或皮质下多发性LI（≥5个）；（3）近6个月无急性期LI。排除标准：（1）脑出血、脑创伤、皮质-皮质下非LI性梗死或皮质梗死；（2）非血管因素引起的WML，如多发性硬化、放射性脑部等；（3）各种感染性疾病、肿瘤性疾病、严重的肝肾疾病；（4）近1个月有手术史或服用米诺环素、环孢素A。选取2016年10月—2017年7月安徽医科大学附属省立医院神经内科收治的SIVD患者115例为SIVD组，其中男60例，女55例；年龄50～85岁，平均年龄（66.1±10.2）岁。选取同期于安徽医科大学附属省立医院体检且颅脑MRI未见明显异常（Fazekas评分［6］≤1级且皮质下LI＜5个）的69例体检者为对照组，其中男41例，女28例；年龄50～85岁，平均年龄（63.2±9.3）岁。受试者均知情并签署知情同意书，本研究经安徽医科大学附属省立医院临床研究伦理委员会批准。

1.2 研究设计

1.2.1 一般临床资料采集 详细记录入院后所有受试者性别、年龄、高血压、糖尿病、冠心病、吸烟、饮酒等资料；受试者空腹12 h以上，于次日采集静脉血3 ml，常温下静置60 min，以3 000 r/min离心15 min，离心半径为13.5 cm，提取血清，采用日立7600-020全自动生化分析仪检测总胆固醇、三酰甘油、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）。

1.2.2 颅脑MRI评价 采用3.0 T的MRI机（德国西门子公司）进行扫描，依据颅脑MRI的T1、T2、FLAIR结果对所有受试者脑部损伤程度进行评价。根据Fazekas评分将WML分为0～3级：0级（无WML）、1级（点状病变）、2级（早期融合性病变）、3级（弥漫性病变），Fazekas评分越高表示脑部损伤程度越重。LI数量：计数位于皮质下直径3～15 mm、边界清楚的缺血性病灶，LI数量越多表示脑部损伤程度越重。

1.2.3 血清MMP-9水平测定 受试者空腹12 h以上，于次日采集肘静脉血5 ml置于不含添加剂的采血管中，常温下静置30 min，以3 000 r/min离心10 min，离心半径为13.5 cm，吸取上清液，存于-80 ℃冰箱待测。采用酶联免疫吸附法测定血清MMP-9水平，严格按照试剂盒（上海源叶生物科技有限公司）说明书进行操作。

1.3 统计学方法 采用SPSS 16.0软件进行统计学分析。符合正态分布的计量资料以表示，两组间比较采用独立样本t检验；非正态分布的计量资料以M（P25，P75）表示，两组间比较采用Mann-Whitney秩和检验；计数资料的分析采用χ2检验；相关性分析采用Spearman秩相关分析；采用多因素Logistic回归分析SIVD的影响因素。以p＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组一般临床资料比较 两组性别、年龄、冠心病、吸烟、饮酒所占比例、总胆固醇、三酰甘油、HDL-C、LDL-C比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；SIVD组患者高血压、糖尿病所占比例高于对照组，差异均有统计学意义（p＜0.05，见表1）。

表1 两组一般临床资料比较Table 1 Comparison of general clinical data between the two groups

2.2 两组血清MMP-9水平、脑部损伤程度比较 SIVD组血清MMP-9水平、Fazekas评分、LI数量高于对照组，差异均有统计学意义（p＜0.001，见表2）。

表2 两组血清MMP-9水平、脑部损伤程度比较Table 2 Comparison of serum MMP-9 levels and brain injury between the two groups

2.3 血清MMP-9水平与脑损伤程度相关分析 SIVD组患者血清MMP-9水平与Fazekas评分、LI数量均呈正相关（rs=0.301、0.395，p＜0.001）。

2.4 SIVD影响因素的多因素Logistic回归分析 以是否患有SIVD（赋值：是=1，否=0）为因变量，以高血压（赋值：是=1，否=0）、糖尿病（赋值：是=1，否=0）、血清MMP-9水平为自变量进行二分类多因素Logistic回归分析，结果显示，高血压、糖尿病、血清MMP-9水平均是SIVD的独立影响因素（p＜0.05，见表3）。

表3 SIVD影响因素的多因素Logistic回归分析Table 3 Multivariate Logistic regression analysis for influencing factors for SIVD

3 讨论

SIVD是中老年人群较常见的脑小血管病，既可导致患者躯体功能障碍，亦是血管性痴呆最常见的病因（占36%～67%），给患者、家庭、社会带来沉重的负担。除年龄、高血压、糖尿病等主要危险因素可导致脑小血管病变外［1］，近年来神经炎症、血-脑脊液屏障损害在SIVD发病机制中的作用受到国内外学者的青睐。

MMP作为一组锌和钙依赖性蛋白水解酶家族，能够降解ECM的所有组分，而参与多种病理和生理过程。MMP-9为MMP家族成员，又称明胶酶B，可降解大多数ECM蛋白，特别是Ⅳ型和Ⅴ型胶原蛋白［7］。既往研究提示，MMP-9与冠心病、动脉粥样硬化、血管性认知功能损害、脑梗死严重程度及预后等密切相关［4，7］。此外，有研究发现MMP-9基因多态性与动脉硬化和脑梗死患病率增加有关［7］。

动物实验表明，MMP-9在正常脑组织中表达水平较低，当脑缺血诱导炎性反应时，可通过各种机制引起MMP-9表达增加，导致血-脑脊液屏障的结构和功能破坏、脱髓鞘改变［4，7］。大量研究均证实，SIVD患者表现为脑血流量降低、血-脑脊液屏障破坏以及脱髓鞘现象［2，4］。POGGESI等［3］研究发现，SIVD 患者的脑白质区血流量较对照组显著减少。TAHERI等［8］利用动态对比增强MRI和清蛋白指数（脑脊液清蛋白/血清清蛋白），均发现SIVD伴血管性认知功能障碍患者脑白质血-脑脊液屏障通透性较对照组明显增加，因此推测MMP-9可能与这些病变有关。本研究显示，SIVD患者血清MMP-9水平较对照人群显著升高，并且与脑损伤的严重程度相关，进一步分析提示其可能为SIVD的独立危险因素。KIM等［6］对137例中老年患者进行研究表明，在校正性别、年龄、心血管危险因素后，血浆MMP-9水平与患者WML具有独立关联，且与Fazekas评分呈正相关。ROMERO等［9］对583名无卒中弗明汉子代人群研究发现，在调整标准血管危险因素后，血浆MMP-9水平与无症状脑梗死及LI无相关性，本研究结果与之不一致，原因可能在于该研究［9］入选者脑梗死程度较轻；但ROMERO等［9］研究显示血浆MMP-9水平与WML存在显著关联，本研究结果与之较为吻合，进一步证实MMP-9在神经炎性反应中参与了SIVD患者脑部损害的过程，尤其是WML。

关于MMP-9在SIVD发病机制的作用可能主要涉及以下途径：（1）在慢性高血压等导致脑深部穿支动脉硬化的过程中，引起巨噬细胞浸润和潴留小胶质细胞激活，释放MMP-9参与ECM的重构，促进管壁增厚、管腔狭窄或闭塞，引起脑组织低灌注以及血栓形成，最终表现为WML和LI［1，4］；（2）脑小血管病变导致脑缺血缺氧可进一步引发炎性级联反应，细胞因子（如肿瘤坏死因子α、白介素1β等）、趋化因子、细胞黏附分子1等炎性递质作用于激活蛋白1和核因子κB转录位点，使MMP-9转录水平上调，引起上述免疫细胞分泌和释放 MMP-9［4，10］。陈新云［11］对缺血大鼠模型研究表明，肿瘤坏死因子α、白介素1β可诱导MMP-9的表达。王敏等［10］通过构建大鼠慢性脑缺血模型进行研究发现，慢性缺血（≥1个月）时大鼠开始出现随时间延长而加重的脑白质疏松、髓鞘脱失，在脑室周围和脑白质疏松处最明显的小胶质细胞激活以及MMP-9持续高表达，该病理改变和人类的WML可能较为一致。表明慢性缺血状态下，炎性细胞因子的释放和胶质细胞的增生可引起脑白质持续表达MMP-9。MMP-9具有双重作用：（1）直接攻击血管ECM，松开紧密连接并分解基底膜，导致血管源性脑水肿、神经元损伤以及血-脑脊液屏障破坏；（2）攻击脑白质有髓纤维，造成非免疫性脱髓鞘性病变［4，6］，通过上述机制最终引起WML。此外，由于血-脑脊液屏障完整性的破坏更有利于炎性细胞进入脑组织，同时MMP-9对多种炎性细胞因子和趋化因子具有正反馈效应，可加重缺血性炎性反应［8-9］。

由于MMP-9作用的复杂性，目前关于MMP-9抑制剂治疗神经炎症的人体试验的报道尚不多见。近年来对动物模型的药物研究发现，米诺环素可通过抑制炎性反应以及抑制MMP-9表达，减轻缺血诱导的脑部损伤，并且改善神经行为学表现［4-5］。另外，环孢素A也被认为对慢性缺血后脑白质损伤有保护作用［5］。研究发现上述两种药物的保护机制可能与抑制胶质细胞的活化有关［5］，因此，将来神经胶质细胞或许可能成为对缺血后脑部损伤干预的新靶点之一。

综上所述，SIVD患者血清MMP-9水平显著升高，其水平升高可能是SIVD发病的独立危险因素，且与WML、LI的严重程度相关。在将来的临床工作中，通过检测SIVD患者MMP-9水平并进行干预，或许可有助于缓解疾病的进展、改善患者的预后。由于本研究样本量有限，且为单中心横断面研究，因此尚需大样本、多中心研究进一步验证。

作者贡献：倪明珠、余锋、王文静进行文章的构思与设计；倪明珠、余锋、徐文、王文静进行研究的实施与可行性分析；倪明珠、王瑶、宋莉莉、刘文灿进行数据收集；倪明珠进行数据整理、撰写论文；倪明珠、徐文进行统计学处理；倪明珠、徐文、王文静进行结果的分析与解释；余锋、王文静进行论文的修订，负责文章的质量控制及审校；王文静对文章整体负责，监督管理。

本文无利益冲突。