EDTA与耐性细菌对黑麦草吸收复合污染红壤中铅镉的影响

史鼎鼎，梁小迪，徐少慧，蒋代华，黄智刚

（广西大学农学院，南宁530004）

目前，重金属污染是人类生活中极为重要的土壤环境问题之一，也是现今全球环境的一个热点、难点问题[1]。重金属污染具有隐蔽性、持久性以及难降解性等多种特性，同时还能够进入到食物链中，对人类的健康及生态环境构成严重的危害[2]。在众多重金属元素中，Cd、Pb经常互相伴随出现，从而导致铅镉复合污染的形成[3-4]。我国南方地区是较为重要的重金属矿区，有色金属矿较多，但由于矿产资源不合理的开采方式，直接导致矿区周边的土壤及其环境受到不同程度的重金属污染[5-6]。近年来，植物修复技术迅速发展，是一种应用前景广阔的新技术。黑麦草（Lo⁃lium Perenne L.）属早熟禾科黑麦草属植物，一年生单子叶植物，具有生长速度快、分蘖多、须根发达、生物量大等特点，能够提高土壤中多种元素的有效态含量，改善土壤的理化性质[7]，同时对重金属具有很强的耐受性以及吸收、积累能力，是作为重金属污染土壤修复较为理想的模式植物之一[8-9]。徐佩贤等[10]研究4种草坪植物对Cd的耐受性与积累特性，结果表明，黑麦草对Cd的耐受性仅次于高羊茅。李松克等[11]研究发现，6年种植黑麦草后，土壤中As、Pb、Cr、Cd 含量分别比种植初期降低了52.71%、45.12%、48.32%、59.15%，单项污染指数分别由种植前的2.67、0.31、1.92和3.48降低为1.26、0.17、0.99和1.42，表明重金属污染土壤得到了不同程度的修复。

在前人的研究中，化学螯合剂能够活化土壤中存在的重金属，以促进植物的富集，进而强化植物对土壤中重金属的吸收[12-13]。EDTA作为一种强大的螯合剂，能够增加土壤溶液中的重金属含量，有效促进植物对重金属的吸收和转运能力。王红新等[14]研究结果表明，EDTA可促进对Pb的溶解并提高其在玉米地上部富集的能力。俞斌等[15]研究表明，EDTA的添加通过提高土壤中酸溶态镍和锌含量，促进甘蔗对镍和锌的吸收及向地上部位转运。而土壤环境中存在着众多微生物，种类繁多，其中细菌的数量最丰富、活动最旺盛，带有电荷，可分泌出大量代谢产物，与植物的生长联系密切，能够促进植物生长，同时还可以通过多种方式来抑制重金属的毒性，强化植物对土壤中重金属的吸收效果[16]。细菌作为一种强化植物吸收重金属的手段，可以在一定程度上缓解重金属的毒性，促进植物的生长以及影响土壤中重金属的生物有效性[17-18]。毛亮等[19]从重金属污染土壤中分别筛出具有耐铅性的绿色木霉菌和具有耐镉性的淡紫拟青霉菌，研究数据表明添加菌后促进了龙葵的生长，并增加了龙葵整个植株体对Cd、Pb的吸收。

因此，本文针对具有南方代表性的主要土类之一——红壤（占广西总面积的35%），采用有机螯合剂EDTA和自行筛选出的耐性细菌J6菌，以一年生黑麦草为供试植物，通过盆栽试验在重金属复合污染状况下，比较有机螯合剂——EDTA和天然生物螯合剂——耐性细菌促进黑麦草吸收重金属Cd、Pb的差异，阐明耐性细菌与EDTA两种方法强化植物富集重金属的优劣，为南方矿区重金属污染土壤的生物修复提供一定的理论依据及技术参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 供试土壤

供试土壤为红壤，采自广西桂林市兴安县境内。该土壤的基本理化性质如表1所示。

1.1.2 供试植物

供试植物为邦德新一代宽叶型四倍体一年生黑麦草（Lolium Perenne L.）

1.1.3 供试细菌

试验所用耐性细菌是本课题组分离筛选获得的。筛菌土壤采自广西崇左市大新县铅锌矿区周边被重金属污染的5～20 cm深的表层土壤，该土壤的Cd、Pb含量分别为2 085.3、50.3 mg·kg-1，有效态Cd、Pb含量分别为192.6、17.5 mg·kg-1，属于铅镉复合重度污染土壤。通过稀释平板法筛选得到重金属铅镉复合耐性菌株，取名为J6菌。

J6菌由上海生工生物有限公司进行菌种鉴定，经过16S rDNA序列测定，该菌是Rhodococcus baikonu⁃rensis，外形为圆形、乳白色、不透明、表面光泽、边缘圆润整齐、直径为2.1～2.6 mm，革兰氏阳性菌，对Pb的最高耐受浓度高达1200 mg·L-1，同时对Cd的最高耐受浓度为80 mg·L-1，在pH 3.0～11.0范围内能够正常生长，适应生长的酸碱度广，对盐也有一定的耐性。

表1 供试土壤基本理化性质Table 1 The basic physical and chemical properties of the tested soil

1.2 实验设计

盆栽试验于广西大学农学院温网室中进行，试验所用塑料盆的上口直径为24 cm，底部直径为20 cm，高为20 cm。供试土壤过1 cm孔径的土筛，混合后每盆装土约5 kg。试验采用双因素完全随机区组设计，因素一为铅镉污染浓度，设置6个水平，各个水平的Cd、Pb浓度分别为0、0 mg·kg-1；5、50 mg·kg-1；10、100 mg·kg-1；20、200 mg·kg-1；50、400 mg·kg-1；80、800 mg·kg-1，并依次以代号A1、A2、A3、A4、A5、A6表示。因素二为分别添加EDTA、接种J6菌，以空白为对照。共18个处理，每个处理重复3次。试验前，使用尿素和 KH2PO4作基肥（N、P、K 的施入量分别为 0.200、0.158、0.200 g·kg-1）；铅镉系列浓度采取外源添加，以硝酸铅和硫酸镉形式配成溶液后采用喷雾的方式均匀加入土壤中，空白处理作对照。土壤含水量保持在田间持水量的60%，陈化一年。播种前，对黑麦草种子进行筛选、浸种消毒以及催芽等各种处理。播种时先用小铁锹取出约2 cm厚的红壤表土，将萌芽种子均匀撒入盆中并用表土覆盖后浇水以达到保持土壤含水量为田间持水量的60%的目的。生长约2～3周后间苗，每盆留苗200株。

1.3 样品采集及测定

黑麦草种植3个月后收割，截取地上部并称鲜质量。105℃杀青，65℃烘干至恒质量，称其干质量，粉碎保存备用；黑麦草根须部采集完根际土后，清洗后放置烘箱，105℃杀青，65℃烘干至恒质量，称其干质量，粉碎保存备用。

植株样品，采用HNO3-H2O2消解-ICP-MS法测定重金属Cd、Pb含量：称0.100 0 g样于50 mL消煮管中，加入8 mL HNO3（优级纯）后放置过夜。先石墨消煮炉80℃低温消解，待管口冒棕色烟时，升温至160℃消解至液体变为浅黄色。取下冷却后加入4 mL 30%H2O2，消解2 min后，消煮炉升温至120℃，消煮30 min，再次冷却加2 mL 30%H2O2，反复操作3次，第三次加2 mL 30%H2O2，待H2O2完全分解后，升温至160℃继续消解至液体清澈透白，剩余液体4 mL左右，即为消解完全。待测液转移至50 mL容量瓶中，定容、过滤、保存。采用ICP-MS测定植物样中的Cd、Pb含量。

根际土壤，湿法消煮-ICP-MS测定Cd、Pb全量：称0.150 0 g根际土于50 mL消化管中，加5 mL HNO3（优级纯），放置过夜。用石墨消煮炉80℃低温加热2 h，升温至120℃消解2 h，升温至160℃消解至液体变为淡黄色澄清，固体剩余量少且发白，管内外无棕色气体附着，即为消解完全。冷却后，同上述植物样消解方法中加入30%H2O2，反复操作3次（每次加完H2O2后100℃消解1 h，升温至120℃消解1 h）。待测液转移至50 mL容量瓶中，定容、过滤，采用ICP-MS测定Cd、Pb含量。

采用DTPA浸提-ICP-MS法测定Cd、Pb有效态含量：称2.00 g根际土于100 mL白色塑料瓶中，加入20 mL DTPA浸提剂，放置于25℃250 r·min-1的摇床上振荡2 h，过滤，采用ICP-MS测定Cd、Pb含量

1.4 数据处理

试验数据采用Excel 2007和SPSS 19.0软件进行统计分析。转运系数=植物地上部Cd、Pb浓度（mg·kg-1）/植物地下部Cd、Pb浓度（mg·kg-1）[20]。

2 结果与讨论

2.1 EDTA与J6菌对黑麦草生物量的影响

对于针对土壤重金属污染问题的植物修复技术，在一定程度上会受到植物生物量的限制。由表2可知，在A1条件下，添加EDTA的黑麦草生物量低于其他两组处理，且差异显著。在重金属Pb、Cd浓度较低，即A2、A3条件下，接菌处理的黑麦草生物量较高，差异显著。而随着Pb、Cd浓度的递增，接菌处理的黑麦草生物量呈下降趋势。与空白对照相比，EDTA处理的黑麦草总干质量降低，其中，根部干质量明显下降，而黑麦草地上部鲜质量和干质量较高，且水分含量高。与接菌处理相比，在A1、A2、A3条件下，EDTA处理对黑麦草生物量的影响较大，抑制了其生长；随着Pb、Cd浓度的提高，EDTA处理的黑麦草总生物量较高，但其对黑麦草根系的损害更为显著。

江春玉等[21]筛选出一株对碳酸铅、碳酸镉活化能力最强的铅镉抗性细菌WS34，并且通过盆栽试验验证，菌株WS34能够明显提高供试植物的生物量。赵根成等[22]通过室内盆栽试验研究表明，外源添加菌PSQ、Ts37、C13以及shf2对蜈蚣草生长有明显促进作用，其生物量、根系活力及根系体积均有不同程度的增加。本实验则表明：在A1、A2、A3条件下，接种J6菌能够提高黑麦草的生物量，更好地促进黑麦草生长。而在重金属高浓度，即A4、A5、A6条件下，接种J6菌后黑麦草生物量出现降低现象，原因可能是J6菌活化了土壤Pb、Cd离子[23]，促进了黑麦草对Pb、Cd的吸收，而吸收过高浓度的重金属元素影响到叶绿体的相关酶活性，破坏相关结构及功能，导致叶绿素含量降低，植物的生物量相应减少[24-26]。在重金属浓度梯度条件下，接菌处理后黑麦草的根系干质量均高于添加螯合剂EDTA，提高了3%～40%，表明接种J6菌比EDTA有利于黑麦草的生长、发育。

表2 两种处理对黑麦草的生物量的影响Table 2 The weight of Lolium perenne in two treatments

2.2 EDTA与J6菌处理对黑麦草Pb、Cd含量的影响

图1表示了添加EDTA与J6菌处理下黑麦草地上部以及根部的Pb、Cd含量的变化。图1（a）与图1（b）通过对比可知，黑麦草根部Pb浓度远高于地上部Pb浓度。在无重金属处理，即A1条件下，相比空白对照，EDTA处理、接菌处理的地上部、根部的Pb含量较低。在重金属低浓度，即A2、A3、A4条件下，与EDTA相比，除A2条件中接菌处理地上部Pb含量较低外，接菌处理的地上部、根部Pb含量均较高，且A2、A3条件下的根部Pb含量差异显著。在重金属高浓度，即A5、A6条件下，与空白对照相比，接菌处理的根部差异显著，分别高出 126、151 mg·kg-1；EDTA处理的黑麦草地上部Pb含量分别高出61、196 mg·kg-1，而根部Pb含量则较低，且差异显著。结合图1（c）与图1（d）可知，黑麦草根部的Cd含量远高于地上部的含量，与吸收Pb的规律相似。在无重金属处理，即A1条件下，接菌处理的根部Cd含量略高于空白对照，在除A4条件的重金属低浓度，即A2、A3条件下，接菌处理的Cd含量略高于空白对照，但A4条件下，接菌处理的Cd含量则较低，差异显著。在A5条件下，接菌处理的地上部Cd含量高于空白对照，而根部Cd含量较低；在A6条件下，接菌处理的根部、地上部的Cd浓度均高于空白对照，且地上部Pb含量差异显著。在重金属Pb、Cd浓度梯度下，接菌处理的Cd含量均高于EDTA处理，且差异显著。罗春玲等[27]研究表明黑麦草吸收的Pb、Cd离子主要储存分布于根部，与本试验结果相一致。赵根成等[22]研究表明，外源添加菌PSQ、Ts37、C13以及shf2有效提高了蜈蚣草积累砷的能力。本试验结果也表明接种J6菌能够促进黑麦草对Pb、Cd的吸收，提高黑麦草对Pb、Cd的积累能力，同时表明接菌处理的效果要优于添加EDTA。

2.3 EDTA与J6菌处理对根际土铅镉含量的影响

图1两种处理下植物地上部及根系的Pb、Cd浓度Figure 1 The Cd or Pb concentration of plant aboveground and roots in two treatments

图2 表示EDTA与J6菌处理对根际土Cd、Pb全量以及有效态的影响。由图2（a）可知，在不同的重金属浓度梯度下，EDTA处理比接菌处理的Cd全量接近于空白对照，接菌处理的Cd全量均较低，且与其他两组差异显著，同时随着重金属浓度的增加，差距也愈加明显。由图2（b）可知，与空白对照相对比，EDTA与接菌处理均较低，且差异显著，Pb全量从低到高顺序依次为接菌＜EDTA＜空白，同时随着重金属浓度的增加差距逐渐加大。在重金属低浓度，即A2、A3、A4条件下，EDTA与J6菌处理的Pb全量差异不显著；当重金属浓度达到A5条件时，J6菌处理的Pb全量低于EDTA处理，且差异显著。由图2（c）可得，在不同重金属浓度梯度下，各处理间均差异显著，有效态Cd浓度从低到高顺序依次为EDTA＜空白＜接菌。与空白对照相比，接菌处理分别提高了7%（A2）、13%（A3）、10%（A4）、11%（A5）、9%（A6），EDTA处理分别降低了 14%（A2）、45%（A3）、51%（A4）、6%（A5）、16%（A6）。由图2（d）可知，重金属浓度A3、A4条件下，与空白对照相比，J6菌与EDTA处理的红壤有效态Pb浓度较低。在重金属浓度为A5时J6菌处理降低的幅度最大，比空白对照降低了55%。但在重金属浓度高达A6时，接种J6菌和添加EDTA的红壤中有效态Pb都高于空白处理，分别高出21%、17%。

与添加螯合剂EDTA相比，接菌处理后根际土Pb、Cd全量较低而有效态含量较高，表明接种J6菌能够更有效促进根际土的重金属Pb、Cd形态的改变，提高有效态含量，更有利于黑麦草吸收重金属Pb、Cd。可能原因是，一方面，接种J6菌在一定程度上能够提高黑麦草根际土壤微生物数量并改善群落结构，较好地维持根际土壤微生物群落多样性和生态系统功能；另一方面，耐性菌株可能分泌的代谢产物（如有机酸）也能在一定程度上缓解过高浓度重金属对黑麦草根系的伤害，维护黑麦草的根系活力和吸收能力。相关机理需进一步研究。

2.4 EDTA与J6菌处理对黑麦草Pb、Cd转运系数的影响

影响植物吸收重金属元素的主要限制因素包括重金属元素从植物的根系向植物地上部转移的能力，即转运能力[28]。针对黑麦草地上部与根部的Pb、Cd含量的基础分析，进一步探索黑麦草对Pb、Cd的转运能力。图3的（a）、（b）分别表示不同处理中黑麦草Pb、Cd转运系数的影响。由图3（a）可知，与空白对照相比，EDTA处理的Pb转运系数较高，提高了22%～61%，有效提高了黑麦草Pb的转运系数；接菌处理则较低，效果不明显。由图3（b）可知，相对于空白对照，EDTA和接菌处理较高且差异显著。随着重金属浓度的增高，黑麦草Cd转运系数呈先增后降趋势，同时EDTA处理的变化幅度较大。在重金属低浓度，即A2、A3、A4条件下，EDTA处理的Cd转运系数最高，分别提高54%（A2）、55%（A3）、55%（A4），当重金属浓度达到A5后接菌处理的Cd转运系数则高于EDTA。

图2 两种处理下根际土的Cd、Pb含量Figure 2 The concentration of Cd and Pb on rhizosphere soil in two treatments

图3 两种处理对Pb、Cd转运系数的影响Figure 3 The translocation of Pb and Cd in two treatments

3 结论

（1）在A1、A2、A3条件下，接种J6菌能够提高黑麦草的生物量，更好地促进黑麦草生长。

（2）与添加螯合剂EDTA相比，接种J6菌能够提高土壤中有效态Pb、Cd的含量，更好促进黑麦草对Pb、Cd的吸收。对比J6菌-黑麦草、EDTA-黑麦草两种联合修复Pb、Cd复合污染土壤体系的效果，耐性细菌J6菌较螯合剂EDTA对黑麦草吸收Pb、Cd的强化效应更为明显。