不同行为特征肺癌小鼠血管内皮生长因子表达及NK细胞的活性差异研究

臧福才 刘明月 刘敏 唐伟

[摘要] 目的 探討不同行为特征肺癌小鼠血管内皮生长因子（VEGF）的表达及自然杀伤细胞（NK）的活性差异。 方法 Balb/c小鼠80只，雄性，进行旷场试验，筛选高活跃组和低活跃组小鼠，每组各20只；取处于对数生长期的LLC小鼠肺癌细胞，接种于高活跃组和低活跃组小鼠右腋皮下，建立小鼠肺癌模型。两组相同条件饲养14 d后，MMT法检测两组小鼠脾脏NK细胞的杀伤活性；游标卡尺测量肿瘤的长、短径，计算肿瘤体积，电子天平称肿瘤重量；免疫组织化学法检测两组小鼠肿瘤组织VEGF蛋白的表达情况。 结果 高活跃组小鼠NK细胞的杀伤活性为（19.73±3.55）%，高于低活跃组[（16.47±3.29）%]，差异有统计学意义（P < 0.05）。高活跃组小鼠肿瘤体积为（0.78±0.14）cm3，低于低活跃组[（0.94±0.24）cm3]，差异有统计学意义（P < 0.05）。高活跃组小鼠肿瘤重量为（0.84±0.19）g，低于低活跃组[（1.00±0.22）g]，差异有统计学意义（P < 0.05）。高活跃组小鼠VEGF阳性表达率为85.0%，明显低于低活跃组（95.0%），差异有统计学意义（P < 0.05）。 结论 不同活跃程度荷瘤小鼠肺癌组织生长速度不同，可能与小鼠活跃程度影响NK细胞活性、肿瘤组织VEGF蛋白表达有关。

[关键词] 行为特征；肺癌；NK细胞；血管内皮生长因子

[中图分类号] R734.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）05（c）-0018-04

Study on the differences of the expression of vascular endothelial growth factor and the activity of NK cells in lung cancer mice with different behavior characteristics

ZANG Fucai1 LIU Mingyue2 LIU Min1 TANG Wei1

1.Neurology Department， Xinhua Hospital Affiliated to Dalian University， Liaoning Province， Dalian 116021， China； 2.the Second Radiotherapy Department， Handan Central Hospital， Hebei Province， Handan 056000， China

[Abstract] Objective To investigate the differences of the expression of vascular endothelial growth factor （VEGF） and the activity of NK cells in lung cancer mice with different behavior characteristics. Methods Eighty male Balb/c mice were taken open field test to screen high active group and low active group， with 20 mice in each group. The logarithmic phase LLC cells were inoculated in the right axillary subcutaneous of high active group and low active group to establish lung cancer model. After 14 days under the same feeding condition， the killing activity of spleen NK cells in the two groups was detected by MMT method. The long and short diameters of tumor were detected by vernier caliper， the tumor volume was calculated， and the tumor weight was measured by electronic scales. Immunohistochemistry method was used to detect the expression of VEGF in the two groups. Results The killing activity of NK cells in the high active group was （19.73±3.55）%， which was significantly higher than that of low active group [（16.47±3.29）%]， the difference was statistically significant （P < 0.05）. The tumor volume of high active group was （0.78±0.14） cm3， which was smaller than that of low active group [（0.94±0.24） cm3]， the difference was statistically significant （P < 0.05）. The tumor weight of high active group was （0.84±0.19） g， which was lower than that of low active group [（1.00±0.22） g]， the difference was statistically significant （P < 0.05）. The positive expression rate of VEGF in the high active group was 85.0%， which was lower than that of low active group （95.0%）， there was statistically significant difference （P < 0.05）. Conclusion Different activity degrees of tumor-bearing mice have different growth rates of lung cancer tissue， which may be connected with the activity of NK cells and the expression of VEGF protein in tumor tissue.

[Key words] Behavior characteristics； Lung cancer； NK cells； Vascular endothelial growth factor

癌症是目前对人类健康威胁最大的疾病之一[1]。癌症也是一种较为明确的身心疾病，个性行为特征和精神心理因素与癌症的发生、发展有着非常密切的关系。英国学者Greer等结合自己的研究结果，总结了癌症患者的人格特征：压抑自己，不善于将内心的感受和不良情绪外泄，对生活事件所产生的负性情绪，压抑到内心世界[2]。处在开放环境中的动物实验的特征与人存在相似之处。Dellu等[3]认为高活跃程度的大鼠行为与性格开朗、积极探索的人行为相似，低活跃程度的大鼠与消极态度、高度恐惧感和害羞感特征的人相似。

自然杀伤细胞（NK）既是机体内的自然防御细胞，又兼有重要的免疫调节功能[4]。肿瘤血供丰富，其生长离不开血管的生成，而血管内皮生长因子（VEGF）起关键作用[5]。VEGF可诱发肿瘤血管进行性聚集和生成，是目前已知作用最强的血管生成促进因子，与肺癌发生、发展有密切的关系[6-7]。因此阐明不同心理行为特征在癌症发展过程中的作用、个体行为的差异与肿瘤血管生成能力和免疫应答之间的联系，探讨他们之间的机制对预防、治疗癌症具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 实验动物

Balb/c小鼠80只，雄性，体重18～22 g，SPF级，由大连医科大学实验动物中心提供（合格证号：SCXK2015-0002），饲养在24℃、12/12 h光照/黑暗交替的实验环境中，正常饮食，动物适应1周后开始实验。本研究经大连大学附属新华医院实验动物伦理委员会批准。

1.2 材料及仪器

小鼠LLC肺癌细胞（大连大学附属中山医院中心实验室提供）；胎牛血清（FCS）（杭州四季青生物工程材料有限公司）；RPMI1640培养基（GIBCO公司）；小鼠淋巴细胞分离液（朗顿生物技术有限公司）；兔抗小鼠VEGF多克隆抗体（博士得生物工程有限公司）；SP-9001免疫组化试剂盒（中杉金桥生物技术有限公司）；DAB显色剂（中杉金桥生物技术有限公司）。NU-4750E型CO2培养箱（LABNET公司）；低温超速离心机（HITACHI公司）；BHC-1300Ⅱ超净工作台（东联哈尔公司）；Katoo RT2100酶标仪（雷杜生命科学股份有限公司）；石蜡切片机（Leica RM2135德国）；细胞计数板（上海实验仪器厂）；显微镜（OLYMMPUS公司）。

1.3 细胞培养

LLC肺癌细胞为贴壁生长细胞，将其培养于含10%FCS的RPMI1640培养液中（内含100 μg/mL青霉素和100 μg/mL链霉素），于37℃、5%CO2饱和湿度下培养，每2～3天传代1次。

1.4 动物分组

旷场试验：将小鼠轻轻地放于旷场试验（open field test）反应箱中（旷场试验箱为50 cm×50 cm×30 cm的木质箱，内部涂为黑色，底面用白线划分为等大的25个正方形小格子）。让小鼠随意活动，记录每只小鼠3 min内穿越的格子数（由3个实验员共同完成）。将小鼠第2、3、4天行走距离的平均值作为分组标准：将穿越格子总数处在上四分之一位数的小鼠定义为高活跃组，将穿越格子总数处在下四分之一位数的小鼠定义为低活跃组[8]，每组各20只。

1.5 Balb/c小鼠实体荷瘤模型建立

取处于对数生长期的LLC细胞（长满80%），成瘤时间为1周，经胰蛋白酶消化后，1200 r/min，离心4 min，用无菌生理盐水洗涤肿瘤细胞，并调整细胞浓度为1×107/mL以供注射。在无菌条件下接种于小鼠右腋皮下，每只小鼠接种0.2 mL细胞悬液（包含细胞数2×106），注射局部出现明显皮丘。

1.6 脾脏NK细胞杀伤活性测定

1.6.1 效应细胞制备 颈椎脱臼法处死小鼠后，立即将小鼠浸泡在75%医用酒精中，2 min后无菌条件下取出小鼠脾脏，磷酸缓冲液（PBS）冲洗3遍，尽量洗净血细胞，用眼科剪将脾脏剪碎，用10 mL玻璃注射器针芯在200目不锈钢网筛中研磨、过滤，洗涤3次，制成脾细胞悬液3 mL，将其加入含有小鼠淋巴细胞分离液的试管中，然后1200 r/min离心4 min，收集白膜层，再用PBS洗涤，最后室温下1640培养基孵育4 h，去除单核细胞，收集细胞悬液，然后1200 r/min离心4 min，收集离心的细胞并调整细胞浓度为5×106/mL。

1.6.2 靶细胞制备 显微镜观察LLC细胞的生长状态，待LLC细胞生长至对数期时，将其制备LLC单细胞悬液，调整细胞浓度为5×104/mL备用。

1.6.3 细胞毒实验 将效应细胞、靶细胞各50 μL（效靶比为100∶1）加入到96孔板中，每个样本设置3个复孔，同时设置单独效应细胞对照孔和单独靶细胞对照孔，在37℃、5%CO2的恒温箱中培养4 h，之后每孔加入5 mg/L的噻唑蓝（MTT）10 μL，继续孵育4 h，之后再加入10%十二烷基硫酸钠（SDS）-50%二甲基甲酰胺（DMF）100 μL，待紫色结晶完全溶解，在酶标仪上测570 nm波长的吸光度值（A）。NK细胞杀伤活性（%）=[1-（A效+靶-A效）/A靶]×100%。

1.7 观察肿瘤组织的形态

处死小鼠后，剥离出肿瘤组织，剥离过程注意与周围组织有无粘连，肉眼观察肿瘤组织的大体形态，用电子天平称瘤重；采用精密游标卡尺测量瘤体最大直径（a）和最小直径（b），计算肿瘤体积，并进行两组间的比较。肿瘤体积=1/2（a×b2）[7]。

1.8 免疫组织化学染色检测肿瘤组织VEGF蛋白的表達

采用S-P免疫组织化学方法进行染色。VEGF阳性细胞为胞质着色，胞质出现棕黄色颗粒。判断结果的方法参考相关文献[9]，由两名病理医师双盲法进行阅片，载玻片上组织染色的阳性反应依据胞质及胞核的染色程度：胞质或胞核有棕黄色或棕褐色颗粒沉着即为阳性染色。低倍镜下选择阳性细胞最密集的区域，在高倍镜下选取5个视野，计数每100个肿瘤细胞阳性细胞百分比，取各视野内阳性细胞百分率的平均值。阳性细胞0～10%为阴性（-）；阳性细胞>10%～30%为弱阳性（+）；阳性细胞>30%～50%为阳性（++）；阳性细胞>50%为强阳性（+++），本研究将（+）～（+++）定义为阳性表达。

1.9 統计学方法

采用SPSS 13.0软件进行统计学分析。所有实验重复3次，计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用t检验，等级资料比较采用秩和检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 旷场试验

Balb/c小鼠在旷场试验的活动量存在着相当大的差距，穿越的格子数最少的为0个，最多的为139个，其中取高活跃组20只和低活跃组20只。

2.2 Balb/c小鼠肺癌模型建立

Balb/c小鼠接种LLC肺癌细胞后14 d，发现小鼠右腋下出现黄豆粒大小的肿块，质地坚硬，小鼠的成瘤率为100%。

2.3 两组小鼠NK细胞杀伤活性比较

高活跃组小鼠NK细胞的杀伤活性为（19.73±3.55）%，高于低活跃组[（16.47±3.29）%]，差异有统计学意义（P < 0.05）。

2.4 两组肿瘤组织的大体形态

颈椎脱臼法处死小鼠后，剥离肿瘤组织，观察发现肿瘤组织呈灰红色，质地较硬，与周围组织分界不清，存在粘连。高活跃组小鼠瘤体积为（0.78±0.14）cm3，低于低活跃组[（0.94±0.24）cm3]，差异有统计学意义（P < 0.05）；高活跃组小鼠瘤重为（0.84±0.19）g，低于低活跃组[（1.00±0.22）g]，差异有统计学意义（P < 0.05）。

2.5 两组肿瘤组织中VEGF的表达情况比较

3 讨论

癌症的发生是多阶段、复杂的演变过程。它不仅受到物理、化学、生物等因素的影响，同样也受到精神心理因素的影响。随着科技水平的进步、人类疾病谱的改变，生物医学模式逐渐转变为“生物-心理-社会”医学模式，精神心理因素对疾病的影响日益受到医学界的重视[10]。本研究采用小鼠旷场试验的结果来判别小鼠的活跃程度。旷场试验又称敞箱实验[11]，是根据实验动物在新奇环境中某些行为发生的频率和持续的时间等，来反映实验动物在新奇环境中的自主行为以及以尿便次数来反映紧张度[12-13]。本研究发现，与高活跃组小鼠相比，低活跃组小鼠肿瘤组织重量和体积均较高，说明具有不同行为特征的荷瘤小鼠肿瘤生长速度不同，这也说明稳定的行为特征对肿瘤生长有影响。

肿瘤的发生、发展和转移与机体的免疫功能低下有关。社会心理因素对机体免疫力的影响主要是通过神经内分泌系统实现的，同时这些免疫因子又作用于中枢神经系统，反馈性对心理和行为特征产生影响，引起心理和行为特征的改变[14]。免疫系统是机体主要的肿瘤防御系统，机体抗肿瘤反应以细胞免疫为主。NK细胞是机体内的自然防御细胞，又兼具重要的免疫调节功能[15]。由于NK细胞的杀伤活性无MHC限制，不依赖抗体，因此称为自然杀伤细胞，是机体抗肿瘤免疫的第一道防线[16]。长期压抑的负性情绪通过中枢神经系统激活下丘脑，引起糖皮质激素释放入血。糖皮质激素对几乎所有免疫细胞均有影响，尤其是引起NK细胞活性下降明显，使NK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性下降，最终导致肿瘤的发生[17]。

脾脏是机体重要的免疫器官，脾脏中含有丰富的NK细胞，且实验时易获得，因此本研究选择测量脾脏中NK细胞的杀伤活性来反映机体的免疫力。本研究为了探讨不同行为特征对机体免疫功能的影响，检测高、低活跃两组小鼠脾脏NK细胞的杀伤活性，结果发现高活跃组小鼠脾脏NK细胞杀伤活性明显较高，说明不同行为特征肺癌模型小鼠NK细胞杀伤活性具有一定的差异性。

肿瘤的生长依赖于血管的生成，新生的肿瘤血管为肿瘤生长提供营养物质和氧气。肿瘤细胞和其间质细胞产生的促血管内皮生长因子可诱发血管进行性生成和聚集。其中VEGF的作用是关键环节。VEGF是较强的促血管生成因子，在肿瘤生长过程中，原癌基因的激活和突变、抑癌基因的失活等都可导致VEGF的大量分泌[18]。Neufeld等[19]研究证明机体大量分泌的VEGF能特异性刺激血管内皮细胞增殖，在实体肿瘤的血管生成中起着关键性作用。Demasi等[20]研究表明，肿瘤生长及转移首先要有新血管的生成和构建，否则肿瘤生长及转移的可能性都较小。Amkraut等[21]的研究结果指出不同活跃能力的大鼠其整体血管生成能力不同，低活跃大鼠的血管生成能力较高，这与本研究结果一致。本研究采用免疫组织化学法检测高、低活跃组荷瘤小鼠肿瘤组织中VEGF蛋白的表达，通过对比VEGF蛋白表达的阳性率反映肿瘤血管生成的能力。结果显示，与高活跃组小鼠比较，低活跃组小鼠肿瘤组织VEGF蛋白表达明显较高，这也提示低活跃组荷瘤小鼠肿瘤血管生成能力较强。稳定的行为特征与肿瘤生长存在着密切的关系，这使我们将更加关注行为特征与肿瘤的关系，指导未来进一步研究。

[参考文献]

[1] Nakaya N. Effect of psychosocial factors on cancer risk and survival [J]. J Epidemiol，2014，24（1）：1-6.

[2] 李心天.医学心理学[M].北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1998：372-374.

[3] Dellu F，Piazza PV，Mayo W，et al. Novelty- seeking in rats-biobehavioral characteristics and possible relationship with the sensation-seeking trait in man [J]. Neuropsychobiology，1996，34（3）：136-145.

[4] Marcus A，Gowen BG，Thompson TW，et al. Chapter three-recognition of tumors by the innate immune system and natural killer cells [J]. Adv Immunol，2014，122：91-128.

[5] 朱静，万远廉，刘玉村，等.血管生成与肿瘤[J].现代肿瘤医学，2007，15（3）：428-430.

[6] 张朝清，刘丽，吴定滨.VEGF及微血管密度在非小细胞肺癌中的表达及VEGF与临床病理特征的关系[J].海南医学，2017，28（14）：2254-2256.

[7] 任卫华.血管内皮生长因子及其受体系统与肿瘤生长相关性的研究进展[J].肿瘤学杂志，2015，21（7）：611-614.

[8] 秦竹，秦越，籍莉，等.麻黄附子细辛汤对心境障碍抑郁型大鼠模型行为学影响的研究[J].江西中医药大学学报，2017，29（2）：70-71.

[9] 许良中，杨文涛.免疫组织化学反应结果的判定标准[J].中国癌症杂志，1996，6（4）：229-230.

[10] Borras JM，Albreht T，Auudisio R，et al. Policy statement on multidisciplinary cancer care [J]. Eur J Cancer，2014，50（3）：475-480.

[11] 李旻.自拟解郁方抗抑郁作用的实验研究[J].中医临床研究，2017，9（17）：7-8.

[12] 袁树民，张晓娟，张海涛.阿尔茨海默病模型小鼠自主活动能力的分析[J].中国比较医学杂志，2010，20（4）：5-8.

[13] Li CQ，Zhang JW，Dai RP，et al. Surgical incision induces anxiety-like behavior and amygdala sensitization：effects of morphine and gabapentin [J]. Pain Res Treat，2010，70（58）：74.

[14] 刘志敏，刘巍.恶性肿瘤患者社会心理问题的研究进展[J].临床肿瘤学杂志，2015，20（1）：87-90.

[15] Marcus A，Gowen BG，Thompson TW，et al. Recognition of tumors by the innate immune system and natural killer cells [J]. Adv Immunol，2014，122（1）：91-128.

[16] 迟海涛，李霞，赵泰成.丰富环境对肺癌荷瘤小鼠肿瘤组织NK细胞活性、KI67蛋白表达的影响[J].现代肿瘤医学，2017，25（16）：2557-2560.

[17] Ben-Eliyahu S，Page GG，Schleifer SJ. Stress，NK cells，and cancer：still a promissory [J]. Brain Behav Immun，2007，21（7）：881-887.

[18] 袁明，王琼，吴丹，等.小细胞肺癌患者癌组织中CD44及血清血管内皮生长因子的表达及临床意义[J].中国综合临床，2017，33（7）：625-627.

[19] Neufeld G，Kessler O，Vadasz Z，et al. The contribution of proangiogenic factors to the progession of malignant disease：role of vascular endothelial growth factor and its receptors [J]. Surg Oncol N Am，2001，10（2）：339-356.

[20] Demasi AP，Silva CA，Silva AD，et al. Expression of the vascular endothelial growth factor and angiopoietins in mucoepidermoid carcinoma of salivary gland [J]. Head Neck Pathol，2012，6（1）：10-15.

[21] Amkraut A，Solomon GF. Stress and murine sarcoma virus（moloney）-induced tumors [J]. Cancer Res，1972，32（7）：1428-1433.

（收稿日期：2017-11-30 本文編辑：张瑜杰）