不同方法炮制人中黄与甘草镇痛抗炎镇咳药理作用的比较研究※

夏云岭 王胜超 张 悦 陈祎甜 张江山 张振凌*

（1 河南中医药大学药学院中药炮制学科，河南 郑州 450046；2 呼吸疾病诊疗与新药研发河南省协同创新中心，河南 郑州 450046）

甘草，豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.、胀果甘草Glycyrrhiza inflata Bat.或光果甘草Glycyrrhiza glabra L.的干燥根和根茎。具有补脾益气，清热解毒，祛痰止咳，缓急止痛，调和诸药的功效[1]。现代药理学研究表明，甘草具有保肝、抗菌、抗病毒、镇咳、抗疟等多种活性[2]，并具有抗炎镇痛的药理作用[3]，人中黄，是将甘草末置于竹筒中，捣实封口，浸渍于人粪坑中一段时间后的制成品，其性寒凉，味甘、咸，归心、胃经，主要具有泻火解毒，清热凉血的功效，多用于治疗天行热、瘟毒、疫戾、痰火、痘疹等疾病[4]，现载于《中华本草》哺乳类。但是由于传统制作过程和生产环境不卫生，造成该种炮制品濒于失传。本实验室前期总结人中黄由来及炮制方法历史沿革[5]，考析其药性功效[6]，探究炮制机理，对其炮制前后的化学成分变化进行了分析对比研究，发现甘草素、异甘草素、甘草查尔酮A、甘草次酸为升高类成分，甘草酸和甘草苷为降低类成分[7]，并在此基础上，设计新的炮制方法，制备成为新的人中黄炮制品[8]。本实验首次以甘草为阳性对照，比较人中黄的镇痛、抗炎、镇咳药理作用，并对新法与传统方法炮制品进行了对比，为传统炮制人中黄的作用机理和进一步研究提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 器材 YP10002型电子天平 (上海衡际科学仪器有限公司)，TGL-16gR型高速冷冻离心机 (上海安亭科学仪器厂)，BS210S型1/1万电子天平 (北京赛多利斯天平有限公司)，YSL-8A型多功能诱咳引喘仪（济南益延科技发展有限公司），8 mm打孔器。

1.1.2 药品与试剂 甘草饮片为安徽亳州市售药材，经河南中医药大学董诚明教授鉴定为豆科植物甘草Glycyrrhizae uraleusis Fisch.的干燥根及根茎；人中黄样品由本实验室按照人中黄制备方法制备。二甲苯 (分析纯），天津市福晨化学试剂厂，批号20060823；冰醋酸 (分析纯)，天津市富宇精细化工有限公司，批号20170826。

1.1.3 动物 清洁级昆明小鼠，体质量 (20±2)g，由山东省实验动物中心提供，许可证号SCXK(鲁)20140007，清洁级动物饲养室饲养。动物实验均符合河南中医药大学动物伦理审查指南的相关规定。

1.2 实验方法

1.2.1 样品制备

1.2.1.1 传统法人中黄样品制备 取直径约10 cm的新鲜竹子，刮去青皮，制成一端封口的竹筒，将甘草粉末 (3号筛)捣实于竹筒内，胶塞封口，熬蜡密封晾干。选无农药的粪池，将密封好的竹筒沉于池底，约60 d取出，清水冲洗至无异味，开竹取出，日夜曝晒约7 d即可。

1.2.1.2 新法人中黄样品制备 取直径约10 cm的新鲜竹子，刮去青皮，制成一端封口的竹筒，将甘草粉末 (3号筛)夯实于竹筒内，胶塞封口，熬蜡密封晾干。将竹筒浸泡于一定浓度氨水桶中，约60 d取出，清水冲洗至无异味，开竹取出，日夜曝晒约7 d即可。

1.2.1.3 水煎液制备 取人中黄粉末，装入茶包中，加20倍量水浸泡0.5 h，煎煮2次，每次0.5 h，过滤，合并煎液，浓缩至0.13 g·mL-1，自制人中黄高、中、低剂量组依次浓缩为0.26，0.13，0.65 g·mL-1。

1.2.2 醋酸扭体实验 取雄性小鼠，随机分为6组，分别为空白对照组、甘草（阳性组）、传统法炮制人中黄组、新法炮制人中黄高、中、低剂量组，每组10只，空白对照组给予等体积生理盐水。连续灌胃给药7 d，末次给药1.5 h后，各鼠腹腔注射0.6%冰醋酸溶液0.2 mL，观察15 min内小鼠的扭体反应（小鼠腹部内凹，后肢与躯干伸张，同时臀部抬起）次数，并计算各组扭体反应镇痛率。镇痛率=（空白对照组平均扭体次数－给药组平均扭体次数）/空白对照组平均扭体次数×100%[9-10]。

1.2.3 二甲苯致小鼠耳肿胀实验 取雄性小鼠60只，分组同1.2.2。连续灌胃给药9 d，于末次给药后1.5 h后，用二甲苯0.04 mL/只均匀涂抹于右耳两面致炎，左耳作为对照。致炎后1 h脱颈椎处死小鼠，以8 mm直径打孔器取下耳缘左、右耳片，称重，以右、左耳片重量差表示肿胀度，并计算肿胀抑制率。肿胀抑制率=（空白对照组平均肿胀度-给药组平均肿胀度）/空白对照组平均肿胀度×100%。

1.2.4 氨水致小鼠咳嗽实验 取小鼠60只，雌雄各半，分组同1.2.2。连续灌胃给药7 d，末次给药后1.5 h，将小鼠放入诱咳引喘仪中，浓氨水喷雾15 s，观察和记录小鼠咳嗽潜伏期（开始喷雾氨水至发生咳嗽的时间）和2 min内咳嗽次数（以腹部收缩、口部张开为指标，记1次咳嗽），计算咳嗽抑制率。咳嗽抑制率=（空白对照组平均咳嗽次数－给药组平均咳嗽次数）/空白对照组平均咳嗽次数×100%。

2 结果

2.1 对醋酸致小鼠扭体的影响 与空白对照组比较，传统法炮制人中黄组（P<0.01）及新法炮制人中黄中剂量组（P<0.001）可显著减少小鼠扭体次数，抑制醋酸致小鼠疼痛反应，疼痛抑制率与新法炮制人中黄剂量呈现正相关。与甘草组比较，传统法炮制人中黄组（P<0.01）及新法炮制人中黄中剂量组（P<0.001）扭体次数明显减少。与传统法炮制人中黄组相比，新法炮制人中黄中剂量组对醋酸致小鼠扭体的抑制作用无显著差异 （P>0.05）。

表1 对醋酸致小鼠扭体的影响 （）

表1 对醋酸致小鼠扭体的影响 （）

注：与空白对照组比较，1)P＜0.01，2)P＜0.001；与甘草组比较，3)P＜0.05，4)P＜0.01，5)P＜0.001；与传统法炮制人中黄组比较，6)P＜0.05，7)P＜0.01

61.0±10.08 57.2±14.057)42.9±14.661,4)31.1±8.502,5,6)34.3±7.472,5)45.6±10.071,3)组别 只数 疼痛抑制率（%）空白对照组甘草组传统法炮制人中黄组新法炮制人中黄高剂量组新法炮制人中黄中剂量组新法炮制人中黄低剂量组给药剂量（g·kg-1·d-1）扭体反应（次）10 10 10 10 10 10-1.3 1.3 2.6 1.3 0.65-6.23 29.67 49.02 43.77 25.25

2.2 对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响 与空白对照组比较，甘草组对二甲苯致小鼠耳肿胀有较明显的抑制作用（P<0.05），传统法炮制人中黄组和新法炮制人中黄中剂量组则未显示抑制作用。

表2 对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响 （）

表2 对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响 （）

注：与空白对照组比较，1)P＜0.01

组别 只数 肿空白对照组甘草组传统法炮制人中黄组新法炮制人中黄高剂量组新法炮制人中黄中剂量组新法炮制人中黄低剂量组给药剂量（g·kg-1·d-1）肿胀度（mg）10 10 10 10 10 10-1.3 1.3 2.6 1.3 0.65 15.60±1.90 10.45±2.881)17.36±7.53 10.85±2.981)17.24±2.96 17.78±4.82胀抑制率（%）-33.01-11.30 30.45-10.50-13.94

2.3 对氨水致小鼠咳嗽的影响 与空白对照组比较，甘草组（P<0.001）、传统法炮制人中黄组（P<0.05）、新法炮制人中黄中剂量组（P<0.001）咳嗽次数均显著减少，咳嗽抑制率以新法炮制人中黄中剂量组最高，且镇咳作用与给药剂量呈现一定的正相关性。与甘草组比较，传统法炮制人中黄组镇咳作用显著减弱（P<0.001），新法炮制人中黄中剂量组镇咳作用无显著差异（P>0.05）。与传统法炮制人中黄组比较，新法炮制人中黄中剂量组咳嗽次数显著减少（P<0.001）。与空白对照组比较，各给药组咳嗽潜伏期无显著差异（P>0.05）。

表3 对氨水致小鼠咳嗽的影响 （）

表3 对氨水致小鼠咳嗽的影响 （）

注：与空白对照组比较，1)P＜0.05，2)P＜0.001；与甘草组比较，3)P＜0.001；与传统法炮制人中黄组比较，4)P＜0.05，5)P＜0.001

咳嗽抑制率（%）-56.15 20.35 61.73 56.79 40.10组别 只数 给药剂量（g·kg-1·d-1）咳嗽潜伏期（s）空白对照组甘草组传统法炮制人中黄组新法炮制人中黄高剂量组新法炮制人中黄中剂量组新法炮制人中黄低剂量组10 10 10 10 10 10-1.3 1.3 2.6 1.3 0.65 42.45±8.82 51.20±24.09 37.46±8.79 53.39±28.85 71.65±23.46 71.98±31.23咳嗽次数（次）20.25±6.16 8.88±3.402,5)16.13±4.161,3,5)7.75±2.442,5)8.75±3.062,5)12.13±2.482,4)

3 讨论

实验前期研究[8]，通过比较12批市售人中黄样品和甘草中6种主要化学成分的含量，发现甘草素、异甘草素、甘草查尔酮A、甘草次酸为升高类成分，甘草酸和甘草苷为降低类成分；陈永强等[11]通过筛分到的一株产β-葡萄糖醛酸酶的黄曲霉HC-12对甘草进行液体发酵转化，表明甘草经黄曲霉HC-12转化作用后，甘草中的甘草酸水解为甘草次酸，动物药效学实验说明发酵后甘草的抗炎、镇痛活性较未发酵甘草有显著性提高；潘琼等[3]实验发现甘草甜素具有显著的抗炎镇痛作用，而甘草甜素为甘草酸的钾、钙盐，分解可得到甘草次酸；甘草酸类药物在人体内的代谢过程已比较清楚，该类药物经胃酸水解或经肝中β-葡萄糖醛酸苷酶 (glucuronidase)分解为甘草次酸，接着在肝肠循环中经肠内菌作用部分生成3-表-甘草次酸及少量的3-脱氢甘草次酸而起药理活性，故甘草酸类药物起药理功效的成分实质上是甘草次酸[12]。本研究醋酸扭体实验中，同等剂量下比较，传统法炮制人中黄组（P<0.01）、新法炮制人中黄中剂量组（P<0.001）镇痛作用均显著强于甘草组。综上，说明甘草炮制为人中黄后镇痛作用显著增强，与人中黄中甘草次酸含量的升高有关。

传统人中黄是将甘草粉末捣实于竹筒内，密封晾干，沉于粪便池池底约60 d后清水冲洗至无异味，曝晒。便池中因有铵根离子而呈弱碱性，这与以天然甘草提取出甘草酸，再通氨生成甘草酸三铵、甘草酸单铵或甘草酸二铵相类同。二铵盐能使甘草酸在葡萄糖醛酸酶的作用下生成甘草次酸更容易，从而提高了甘草酸转化为甘草次酸的比率，甘草酸为五环三萜类齐墩果酸型结构，无论是α体还是β体，其苷元甘草次酸抗病毒、抗炎作用比甘草酸的活性强得多[13]。故人中黄无论新老炮制方法，均提供氨碱环境，促进了甘草酸铵的生成，为甘草酸进一步转换为甘草次酸发挥药理作用奠定了基础。人中黄主要用于天行热、瘟毒、痰火、痘疹等热症，传染性、病毒性疾病。天行热，即温病，系指感受温邪所引起的一类外感急性热病的总称；瘟毒，瘟疫病邪中具有毒性者；痰火，体内痰浊与火邪互结或痰浊郁久化火的病理变化；痘疹，因患天花出现的疱疹。实验结果显示，甘草经新法及传统法炮制为人中黄后，抗炎作用不明显，镇咳作用不显著，可能与人中黄功效应用与甘草相比发生了变化有关。对人中黄药性及功效的探究尚需进一步研究。